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分子杂交技术  分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生 物分子的一门技术。 样 分 子 品 电 转 杂 制 泳 膜 交 原 备 结 理 杂 果 及 交 显 流 示 程 探 针 制 备 图 RNA 一. 分子杂交种类 DNA DNA 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 RNA 蛋白质 一. 分子杂交种类 2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA ，RNA或蛋白质样品，可同时处理大 量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特 定的DNA 、RNA或蛋白质序列。 2 ）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA ，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上 进行杂交，不能测定分子量大小。 一. 分子杂交种类 3 ）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上， 与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 * iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的 探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去 非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这 种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA 样品 二、 分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA 的杂交 制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。 2 ）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封 闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显 色反应（EIA ） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA ） 三、 杂交样品膜的制备 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚