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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳基本原理： COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷， 因此可以用电泳技术分离和鉴定。 电场力 F=XQ （X：电场强度， Q：电荷量） 阻力 F=6πγηυ （γ：半径，η：介质粘度） 当电泳颗粒匀速运动: F= F? QX=6πηγν ν/X=Q/6πηγ 带电粒子的迁移率 ν/X 用U表示，称迁移率（mobility） 即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。 Q越多，V越大；r越小，V越大；球形分子纤维状 影响电泳速度的因素： 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 电泳介质的pH和离子强度 电渗作用 按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳 盘状电泳通常是不连续系统，利用缓冲液离子成分、pH、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、 浓缩效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED, 形成三维网状凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反应： 缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。 三大效应：浓缩效应 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.9 小 有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。 实验步骤 1.制备PAGE胶柱 画线，封口：在一端取7cm和7.5cm两处画线，此 端管口插入橡皮垫。 制备分离胶：配制好7.5%分离胶，缓慢注入玻璃管 7cm处，加水防止氧化，室温下聚合 聚合20-30min。 制备浓缩胶：配制好3%浓缩胶。将胶上层水倾倒出 去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封 水。室温下聚合20-30min。 2. 上样和电泳：将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡, 加样品液50μl至浓缩胶面。加电解液直至装满上电泳槽。电泳约1.5hr。 3. 染色，观察结果：将胶从玻璃管中取出，注意不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色，然后脱色，脱色至背景清晰。观察结果。 结果示意图： γ β α2 α1 清蛋白 1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 2．制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。 3．注意观察实验现象：分界面，浓缩效应. 4. 氨基黑染色﹑脱色﹑染液回收。 5．固体胶切忌倒入水池。 注意事项：