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活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 细胞生长曲线绘制-MTT 法 摘要 ：通过 MTT 法可以得到细胞的生长曲线 ，也可对瞬时转染后的细胞进行检测 ，本文主要介绍了 MTT 的作用原 理及实验操作要点。 MTT 全称 3-(4 ，5-二甲基噻唑-2)-2 ，5-二苯基四氮唑溴盐 ，商品名为 ：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT 主 要有两个作用 ：① 药物 （或其他处理方式如放射线照射 ）对体外培养的细胞毒性的测定 （如细胞瞬时转染表达后 可对细胞进行 MTT 检测 ）② 用于细胞增殖及细胞活性的测定 ，可以制得细胞生长曲线。 MTT 法检测细胞存活和生长的主要机理是 ：活细胞中的某些物质 （线粒体中的琥珀酸脱氢酶 ）能够和 MTT 反应 ， 使 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （图 1 ）并沉积在细胞中 ，而死细胞没有此功能。DMSO （二甲基亚砜 ） 能够将此结晶 （蓝紫色甲瓒 ）溶解 ，在酶联免疫检测仪 490nm波长处测定其吸光值 ，能够间接的反应活细胞的数 量。一定范围内 ，蓝紫色结晶沉淀的数量与细胞数成正比。目前 MTT 法因其灵敏度高 ，经济快速等优势被广泛的 运用于细胞毒性试验 ，肿瘤药物的筛选、放射敏感性测定和对某些生物活性因子的活性检测等方面。MTT 法也有 自身的缺点 ，如 MTT 检测生产的蓝紫色产物 （甲瓒 ）不溶于水 ，需被溶解后才能检测。一方面使得工作量增加 ， 另一方面对实验结果的准确性产生一定的影响 ，且用于溶解甲瓒的有机溶剂对人体有一定的危害。细胞瞬时转染表 达后的细胞也可做 MTT 实验 ，多数人不知道是先转染再做 MTT ，还是先做 MTT 再进行瞬时转染 ，这里建议是先 做转染 ，培养一段时间后 （24/48h ），重新接种至 96孔板 ，加药两天左右 ，再进行 MTT 检测。 水不溶性的蓝紫色甲瓒 实验准备 1. 仪器 ：酶联免疫检测仪 ，血球计数板 ，96孔板 ，离心管等 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 2. 试剂 ：MTT 溶液 ，胰蛋白酶 ，DMSO （二甲基亚砜 ），血清培养基 3. MTT 溶液的配制 用 PBS缓冲液溶解 MTT 粉末。PBS （ph=7.4 ）配置 ：Nacl （8g ）+ Kcl（0.2g ）+Na HPO （1.44g ） 2 4 +KH PO （0.24g ）调 pH 7.4,定容至 1L。 2 4 此处 MTT 的浓度为 ：5mg/ml。称取 0.5克 MTT 粉末 ，溶于 100 ml的磷酸缓冲液 （PBS ）中 ，用 0.22 μm滤膜过滤除去溶液里的细菌。在配制和保存的过程中 ，最好避光。如在超净台中配置该溶液 ，可将日关 灯关掉操作 ，同时容器用铝箔纸包住(避光) ，4℃ 避光保存即可。使用勿超过两周 ，一旦 MTT 变色 ，即刻 停止使用。建议是 MTT 最好现用现配 ，分装一定量的 MTT 粉末在 EP管中 ，用的时候现配直接加到细胞 培养板中操作方便也避免浪费。 此外 ，MTT 具有致癌性 ，无论是配置还是实验都要注意做好防护准备。MTT 对菌敏感 ，配置或保存的时候 要保证无菌 ，且要避光。 在进行实验时 ，由于实验作用时间较短 ，因此可不避光 ，但是要将超净台的日光灯关掉 ，效果会更好。 实验操作 1. 常规消化细胞 ，离心收集细胞沉淀 ，用血清培养基悬浮细