第四章-植物组织培养拓展技术.pptVIP

第4章 植物组织培养拓展技术 4.1 细胞培养 细胞培养是将从植物的培养物游离的细胞或细胞团，在人工培养基上进行的培养的方法。通过细胞继代培养，使细胞不断增殖，还能使高等植物的单个细胞经过离体培养后细胞分裂形成细胞团，再经过细胞分化最后产生完整的植株。 4.1.1 单细胞的分离 4.1.1.1 机械分离 先将植物叶片取下经过无菌处理后，在研钵中轻轻研碎，经过一定孔径的纱布或不绣钢滤网过滤，取出过滤后的研磨介质经过低速离心等其他处理使细胞得到纯化。 4.1.1.2 酶解分离 用纤维素酶和果胶酶等酶液处理适合植物外植体即可得到所需要的单细胞。 4.1.1.3 由组织培养物分离 离体培养的愈伤组织分离单细胞。 机械分离法和酶解分离法的比较 4.1.2 单细胞的培养 4.1.2.1 看护培养法 含义：用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 要求：看护愈伤组织处于活跃生长状态；愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。 看护培养的方法 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）无菌条件下，将一小块活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。 （3）将分离的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。 4.1.2.2 微室培养法 含义：人工制造一个小室，将单细胞接种在小室的微量培养基中。 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。 特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 微室培养的方法 先将先由愈伤组织培养诱导，经液体培养基培养制得单细胞悬浮液备用。在无菌条件下，按盖玻片大小在无菌载玻片上涂一圈四环素眼药膏。将制得的单细胞悬浮液中取出一滴3ml只含一个单细胞的培养液，滴在圈内的载玻片上，然后在药膏上放一小段已消毒的毛细玻璃管，将无菌盖玻片盖在涂有一圈药膏的载玻片上，轻压使其与药膏紧密接触，使盖玻片与载玻片之造成一密封的小室。 4.1.2.3 平板培养法 含义：把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层(1mm)在培养皿底上的培养方法。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。 4.1.3 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养是将游离细胞或细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡培养，可以使培养细胞快速大量增殖。 4.1.3.1 分批培养 含义：分批培养是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养。 目的：建立单细胞培养物。 4.1.3.2 连续培养 含义：连续培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉等体积的用过的培养基，培养液中的营养物质得到不断补充。 目的：连续培养是植物细胞培养技术中的一项重要进展，它对于植物细胞代谢调节的研究，对于决定各个生长限制因子对细胞生长的影响，特别是对于次生物质的大量生产等具有一定意义。 4.1.3.3 细胞悬浮培养的应用 悬浮培养的单细胞系是突变体育种的良好材料； 人工种子和快速繁殖上的应用； 种质保存当中的应用； 遗传转化的良好受体，转基因技术的应用； 工业方面一是生产植物次生代谢产物，二是用于生物转化，得到期望的天然化合物。 4.2 原生质体培养 原生质体培养的意义： （1）在植物遗传育种实践方面意义重大。 （2）由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养。 （3）可用于细胞表面的结构与功能的研究，细胞器结构与功能的研究，病毒侵染与复制机理的研究，细胞核与细胞质相互关系，植物生长物质的作用、植物代谢等生理问题的研究。 4.2.1 原生质体分离 材料的选择： 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。 酶： 分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 4.2.2 原生质体的培养 4.2.2.1 固体培养法 将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为?0.6％左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。??? 4.2.2.2 液体培养 在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中。 4.2.2.3 固液结合培养法 在培养