感受态细胞的制备和质粒的转化.pptVIP

感受态细胞的制备和质粒的转化 感受态细胞的制备 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 实验材料：大肠杆菌菌株DH5?或DH10B 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA； 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 前夜接种受体菌（DH5?或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 细胞悬浮液可立即用于转化