非蛋白氮测定意义.pptVIP

第3章 食品营养组成专用仪器分析技术 生科学院 3.1蛋白质专用仪器分析技术 蛋白质是食品中的主要营养成分, 是食品及饲料等行业生产与研究中的常检项目。蛋白质的传统测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚试剂（lowry）法和考马斯亮蓝（Bradfold）法等，近年来，国内外研究集中在染料结合分光光度法、金属-染料结合分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法等。 蛋白氮与非蛋白氮 蛋白质含量主要通过测定含氮物质来确定。乳中的氮含量包括蛋白态氮（Portein nitrogen，NP）和非蛋白态氮（Non-portein nitrogen，NPN），其中前者占95%，后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质；乳中还有其它含氮物，主要来源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、马尿酸、氨基酸和其它成分，这些成分构成了所谓的非蛋白氮。乳真蛋白（True Protein，TP）即除了非蛋白态氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白，正常情况下，天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。 非蛋白氮测定意义 2001年，国际标准化组织和国际乳品联合会发布了乳制品中非蛋白氮测定的标准方法，该法提出了蛋白氮和非蛋白氮的分离方法，弥补了凯氏定氮法不能区分蛋白氮和非蛋白氮的缺陷，该方法我国于2008年等同引用。 非蛋白氮测定意义 传统上乳蛋白测定采用凯氏定氮法，它测定的是乳中总氮的含量，再乘以乳蛋白氮与蛋白质的换算系数6.38，即为乳蛋白质含量。这样得到的蛋白质含量被定义为粗蛋白（crude Protein，CP），因为它含有蛋白氮和非蛋白氮。随着乳的计价更倚重真白质，对测定真蛋白（TP）则变得越来越重视，因为只有真蛋白才有营养价值。 随着分析手段的不断进步，如何准确、快速、高效、低成本的测定蛋白质含量，是食品行业面临的重要问题之一，也是检测技术发展的重要方向。基于此，采用新型指示剂，并结合指示剂的生物技术，可准确、快速、便携、高效准确的检测出牛奶中的蛋白含量。 3.1.1凯氏定氮法 凯氏定氮法是1833年由Kieldhal首先提出的，是最为经典的蛋白质测定方法，测定结果的准确度和精密度都很高，适宜于测定固态或液态的样品。直到现在，在国内外仍然应用普遍。 3.1.1.1凯氏定氮法的基本原理 含氮的有机物与浓硫酸共同加热时，其中的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水逸出，有机氮转化为氨，并进一步与硫酸结合生成硫酸铵。通常称此过程为“消化”。 但是这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾来提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行，指示消化终点的到达。 浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所消耗标准酸的当量数计算出待测物中的总氮量，再乘以蛋白质系数即为蛋白质的含量。 直接法与间接法 在测定粗蛋白的基础上，美国科学家于二十世纪九十年代己完成由凯氏定氮分析乳中真蛋白的方法。主要有直接法和间接法，直接法的原理为采用最终浓度为10%w/v的三氯醋酸沉淀乳中的蛋白质，用过滤法除去非沉淀部分的三氯醋酸溶液和非蛋白态氮成分，将滤渣收集起来，用传统的方法进行定氮。间接法则与直接法相反，先测定乳中的总蛋白，再测定其非蛋白态蛋白，总蛋白减去非蛋白态蛋白则得到真蛋白含量。 3.1.1.2凯氏定氮法的优缺点 凯氏定氮法是测定总有机氮的最准确的方法，是各种蛋白质含量测定方法的基础。经过不断的研究改进，该法具有应用范围广、灵敏度高、回收率较好、使用仪器设备简单等优点。但是该法操作费时，消化一个样品至少需要2个小时，完成整个操作流程一般需要5个小时左右，并且在消化过程中产生大量的有害气体(二氧化硫)污染工作环境，危害操作人员的身体健康。所以该法一般只能在实验室中由训练有素的实验员来完成。 凯氏定氮法是生化研究中最基本的分析方法之一。为了达到能快速分析控制、减少环境污染、简化操作过程、缩短测定时间等目的,人们又陆续创立了不少快速测定蛋白质的方法。如双缩脲法、福林一酚法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法、近红外光谱法等。 3.1.2 UDY染料染色法 UDY染料染色法只结合蛋白质包括酪蛋白和乳清蛋白，UDY采用蛋白与一定pH的橙酸12染料结合的原理测定乳中的氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸，其中多肽链长度须在5个氨基酸以上。其红色的色泽随结合的蛋白质含量而变化，色泽的减退与蛋白的浓度呈反比，因此只要在一定的波长下测定其色泽的程度，即可计算得到蛋白的浓度。 3.1.3红外法 红外法采用的是不同分子的物质与特定波长下的反应，因此既可以测定总蛋白，亦可以测定真蛋白，应用时以标定的物质为基础。UDY法只结合蛋白质的部分多肽