分子生物学常用技术下(1).pptVIP

* * * * * -have to know location of oligos to analyse code -walk through movie SLOWLY * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 机制 dsRNA的形成 短干扰RNA的产生 靶mRNA的降解 靶序列的选择： a.基因外显子编码区的dsRNA能产生特异和高效的抑制作用， 对应于内含子序列的dsRNA不能产生可检测的抑制效应。 b.在构建载体时，应选择cDNA分子中的可读框序列 c.避免起始密码子下游和终止密码子上游50～100nt范围内序列 d.避开多个串联的G、T或A碱基的区域 e.GC含量应该小于50％ f.与其他基因无同源性 g.同时构建两个以上对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体 方法 化学合成。 体外转录。 RNase III 家族的酶（例如：Dicer，RNase III ）切割长链dsRNA。 用PCR法合成siRNA表达结构，并在细胞中表达。 向细胞中导入可表达siRNA的质粒载体或病毒载体，并使之表达。 向细胞中转染siRNA 步骤： a.设计并合成siRNA; b.利用脂质体将siRNA 导入细胞 c. 具有相同序列的mRNA降解 d.细胞或个体不能合成相应的蛋白质，表现出功能缺失表型 检测：RT-PCR，WB 对照：阴性，阳性，空白 3. 反义核酸技术: 根据核酸杂交原理设计的选择性抑制特定基因表达的实验技术。 1) 种类：反义DNA(oligodeoxymucleotide,ODNs)、 反义RNA、核酶（ribozyme)、DNAzyme 2) 生物学作用：抑制靶基因的表达 3) 设计：随机筛选靶点 4) 长度: 15~20nt 5)机理： 空间位阻：与mRNA或DNA双链 形成的RNA/DNA杂交体激活RNaseH活性 阻止mRNA的拼接 阻止靶基因的复制或转录 6)修饰 改变立体构型：由天然的β型糖苷键改为α型 化学修饰：即ODNs磷酸糖骨架的磷酸二酯键被 一些化学基因取代ODNs末端修饰 肽核酸 7)问题 非反义效应 靶mRNA的不可接近性 反义核酸进入细胞后可与其它分子如蛋白相互 作用，可能引起一系列的副作用 RNase H作用特性的影响 反义核酸的剂量-效应曲线局限的范围非常窄 8) 应用前景：反义药物，基因功能研究 4.蛋白质的相互作用 基于文库筛选的方法：酵母双杂交、表面展示技术 生物物理方法：免疫共沉淀、蛋白质亲和层析、 交联技术和荧光共振能量转移技术 遗传学方法：基因外抑制子、合成致死筛选 (1)酵母双杂交：通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质。 LexA=BD+AD 转录激活因子由DNA结合结构域和激活结构域组成 步骤： a.构建诱饵质粒 诱饵基因亚克隆至BD表达载体 诱饵蛋白在酵母中表达的鉴定：Western-blot 诱饵质粒自激活作用的检测 b.构建至AD表达载体cDNA文库的扩增：库容108 c.筛库：将重组BD和AD质粒分别或同时转染酵母报告菌株， 利用报告基因筛选阳性克隆 d.PCR反应鉴定 e.测序 f.蛋白相互作用的验证： g.功能研究 体系：Gal4(最常用)、LexA/Gal4、LexA/VP16 优点：高敏感性，适用于细胞核内外多种蛋白质之间 相互作用的研究。 缺点： a.不适宜于转录因子相互作用蛋白质的筛选 b.酵母细胞中蛋白质翻译后修饰比较简单 c.通过酵母双杂交筛选获得的多为EST片段 d.存在假阳性与假阴性的问题 应用 根据研究目的可分为三类： a.明确两种已知蛋白之间有无相互作用； b.鉴定已明确有相互作用的蛋白质发生相互作用所必须的功能域以及特定氨基酸的改变对相互作用的影响； c.寻找与某一特定蛋白质有相互作用的未知蛋白 其他杂交体系 反向杂交体系：蛋白质相互作用－报告基因产生特殊物质－细胞死亡 蛋白质无相互作用－报告基