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二、质粒不稳定的原因 含质粒菌产生不含质粒菌的频率 两种菌的比生长率的大小 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。 三、提高质粒稳定性的方法 1、选择合适的宿主菌 2、选择合适的载体 3、选择性压力 4、分阶段控制培养 5、控制培养条件 6、固定化 第五节 基因工程菌生长代谢的特点 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长与能量的关系 能量不足时，菌体代谢产生乙酸抑制菌体生长。调控操作参数以控制菌体的生长。 适当提高pH值、培养方式、培养基、代谢工程的方法 菌体生长与前体供应的关系 竞争 第六节 基因工程菌中试 1、工程菌选择 2、反应器设计 3、发酵培养基组成 4、工艺最佳化育参数监测控制 5、计算机的应用 第七节 基因工程菌的培养 一、培养方式 补料分批培养 连续培养 透析培养 固定化培养 二、基因工程菌发酵工艺 1、培养基 碳源：葡萄糖、乳糖 氮源：酪蛋白水解物、色氨酸 无机磷：大分子的合成、糖代谢 2、接种量 过小，延长菌体延迟期 过大，代谢积累物过多 基因工程菌发酵工艺 3、温度 复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成等水平 4、溶解氧 5、诱导时机 6、pH值 三、高密度发酵 高密度发酵的概念 一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50 gDCM/L以上，理论上的最高值可达200 gDCM/L。 高密度发酵的优点 提高-、减少-、降低-、缩短- 1.影响高密度发酵的因素 培养基 C/N 寻找葡萄糖的替代物 溶氧浓度 通气量和搅拌速度 措施：提高氧分压、克隆血红蛋白基因、与小球藻混合培养 pH值 氨水的使用 1.影响高密度发酵的因素 温度 不同的培养阶段采用不同的温度 代谢副产物 二氧化碳、乙酸 2.实现高密度发酵的措施 发酵条件的改进 培养基的选择 建立流加式培养方式 提高供氧能力 构建产乙酸能力低的工程化宿主菌 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 第七节 生物技术药物的分离纯化 一、建立分离纯化工艺的根据 二、分离纯化的基本过程 三、生物分离过程经验法则 一、建立分离纯化工艺的根据 1. 含目的产物的起始物料的特点 2. 物料中杂质的种类和性质 3. 目的产物特性 　　产物的化学、物理和生物学特性 4. 产品质量的要求 　　产品纯度、生物活性、比活 二、分离纯化的基本过程 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化 制剂 产品 三、生物分离过程经验法则 在分离过程中尽早减小样品体积 生物分离过程中两个需要尽可能减小的变量是成本和时间 首先，设计者要确定能够满足分离要求必需的分离步骤 此后，分离过程的成本就与样品的体积或流速紧密相关 减小样品体积的实质是除去水分 沉淀、萃取 、吸附、亲和 举例 将耗费最高的分离步骤（通常是高分辨率的步骤）放在最后 原因有二 　1. 分离操作的设备投资和操作费用是与样品流速相关的，虽然高分离成本主要是由高分辨率高所致，但也不难理解此时处理的样品流率也应尽可能低 2.可以在得到合格的产品后立即成形和包装 遵守KISS原则 保持过程简单和笨拙（keep it simple and stupid) 只有当从易于过程控制和故障排除方面考虑时，才会希望用所谓先进的、精致的流程 在能够满足目标的前提下，该过程所包含的步骤应该尽可能少 举例 尽早提炼组分 原因 减少分离步骤 杂质存在导致酶降解或产品变性 举例 其他 依据类似商业产品的生产过程来设计生物分离过程 生物分离过程和生物反应器研发同步进行时的问题 利用模拟料液进行中试实验 　在分离过程设计中，当生物反应器料液不足或产品浓度低于预期值时，一个实用的解决方法是向生物反应器流体中加入目标组分，使其达到预期值。 第三节 包含体的分离与蛋白质的复性 一、包含体 外源蛋白质在E. coli中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体。 二、包含体的形成 部分的折叠的中间态之间相互作用的成果 三、包含体的分离与蛋白质复性 （一）分离 细胞破碎→低速离心或洗滤→包含体沉淀 （二）蛋白质的复性步骤 1. 用含有蔗糖、Triton-100、脱氧