乙肝病毒cccDNA检测.pptVIP

rcDNA不能被扩增 无荧光信号 EcoR I 5‘ + P1 P2 3200(1) 5‘ 3‘ 1590 3‘ 1820 P1 1820 1590 + 3200（1） EcoR I P2 cccDNA能被扩增 检测到荧光信号 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml 结果 ： 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA ·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题 ·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普 通PCR更高 缺陷： 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 质粒标准品107copy/ml 3.5×108copy/ml携带者血清 质粒标准品105copy/ml 105~107copy/ml携带者血清 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) ?侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 2.侵入者探针法(Invader assay) 两个体系： 两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。 荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ (cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。 特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大 一、几个相关问题简介 什么是HBV cccDNA? 即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 乙型肝炎病毒的复制过程 我们为什么要关注HBV cccDNA? ? cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池” ? 目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一 ? 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源 ? 还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世 为什么没有cccDNA检测试剂盒问世? ·研究和开发该检测技术的时间不长 ·检测技术上的难度较大 ·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求 ·现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy /ml左右 ·分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷 ·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA ·如何进一步解决特异性的问题？ ·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？ ·如何简化检测步骤？ 建立cccDNA检测技术必须克服的难点 cccDNA rcDNA 核酸一级结构 完整的双链 两条链均不完整 核酸空间结构 闭合环状，超螺旋 松弛环状，非超螺旋 是否与蛋白质结合 不结合 共价结合 对某些核酸酶抗性 强，不容易被降解 弱，容易被降解 分离cccDNA和rcDNA的分子基础 分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异 二、HBV cccDNA检测技术 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 现有的几种cccDNA检测技术简介 ?选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法 设计一对特殊引物：跨双缺口引物　 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正