掌握酶蛋白纯化过程中的活性.pptVIP

AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 实验二  碱性磷酸酶的提取及其比活性测定 1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法； 2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算； 3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。 一、实验目的 二、实验原理 本实验采取有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆中提取分离碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（Specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U/mg ? pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：（1）每ml样品中的蛋白质mg数（mg/ml）；（2）每ml样品中的酶活性单位数（U/ml）。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。 于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位（King-Armstrong法）可定义为：在37℃保温15min每产生1mg的酚为一个酶的活性单位。 样品中蛋白质含量测定用改良Lowry(Folin-酚试剂)法测定。 AKP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。 临床意义：血清AKP活力增高常见于 -肝胆疾病（胆道阻塞等） -骨骼疾病（佝偻病等） -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童 ① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织 本次实验：兔子的肝脏 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法 ： 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞 ② 生物组织与细胞的破碎 选择合适分离提取方法 把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉 把酶从溶液中提取出来 有机溶剂分段沉淀法 原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。 有机溶剂方法—— ① 正丁醇 能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中 ② 乙醇 30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态 ③ 丙酮 33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态 有机溶剂： 通过离心，去除部分杂蛋白 通过离心，进一步去除杂蛋白 三、操作步骤 ? ? AKP的活性测定：取试管6支，按下表操作： 混匀，室温放置10分钟后，510mm处测吸光度。 （A B C D） （6管） （A B C D） （6管） 0.3mg/ml 计算AKP的比活性： AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定 AKP提取及其比活性测定