免疫共沉淀解析.pptVIP

免疫共沉淀 (CO—immunoprecipitation)   用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。 免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。 基本原理  细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物，若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细 胞构建成cDNA文库，以上述核苷酸序列为 探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆 。 实验流程       （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适 量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解 液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量 裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖 珠加入到和抗