毕赤酵母的基因表达及其初步纯化.pptVIP

* * * * * 4Aβ15基因在毕赤氏酵母中的分泌表达及初步纯化 ——Alade 毕赤氏酵母作为表达载体的优点 1、表达效率高，遗传稳定性好 2、结构简单，表达调控机理比较清楚 3、有Pr加工系统 4、培养简单，成本低廉 5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达系统。） 一、实验材料 DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、，pQE4Aβ15 pMD18T载体、Pfu高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶 . PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、羊抗鼠IgG -HRP、增强型HRP-DAB、底物显色试剂盒. 基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程 4Aβ15基因的获取(PCR) ↓ 目的基因的修饰与克隆 ↓ 表达载体的构建 ↓ 毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定 ↓ 目的基因在毕赤酵母GS115中的表达 ↓ 重组蛋白的鉴定与分析 ↓ 重组 4A 15 的初步纯化 1、目的基因4Aβ15获取PCR 在设计 N 端引物时引入XhoⅠ酶切位点及 Kex2 信号肽水解位点，并删除 Kex2后面的 Ste3 位点（Glu-Ala-Glu-Ala） 在下游引物（5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3）引入终止密码子和XbaⅠ酶切位点， 目的基因4Aβ15获取PCR 以 pQE4Aβ15 为模板，进行 PCR 扩增， 扩增条件为 94℃3 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃50 s，35个循环，72℃延伸 10 min，4℃保存. 1.5% 琼脂糖分析 PCR 产物 2、目的基因的修饰与克隆 PCR 扩增产物回收后+克隆载体 pMD18T 以 1：3 （V）的比例通过 T4 连接酶接， 连接产物转入大肠杆菌 DH5α，菌落 PCR 。 分析阳性菌落：挑取 4 个阳性菌落 进行序列分析. 序列正确的命名为 p4Aβ15 3、表达载体的构建 双酶切基因片段p4Aβ15，用试剂盒回收，双酶切质质粒pPICZaA ，回收大片段， 定向连接，连接产物在低盐的LB 平板上培养。 挑取抗性菌落提取质粒，进行双酶切鉴定。 5、毕赤氏酵母GS115的电转化与鉴定——5.1电转化 1、 线性化——限制性内切酶 BstXI 单酶切表达载体和重组质粒 2、电转化——电激转化毕赤酵母 GSll5 感受态细胞（转化条件：电压 1 500 V，4 ms）. 电转化完成后培养 转化物涂布于Zeocin 100 mg /L 的 YPD 平板上，28℃恒温培养36 h 左右，抗性平板上生长的菌落相应的命名GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4Aβ15. 5、毕赤氏酵母GS115的电转化与鉴定——5.2转化子的鉴定 提取抗性菌落的基因组DNA,(方法参见Invitrogen 酵母手册). 以此基因组 DNA 为模板，pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 为引物进行PCR. 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析 6、目的基因在毕赤酵母GS115中表达 挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素……）的培养基上摇床培养（28 ℃，250 r /min 培养至 OD600 为 2~6） 离心收集菌体，用BMMY重悬，至OD600≈1 继续摇床。 . 每 24 h 向培养基中添加无水甲醇（诱导表达产物分泌到培养基中）至终浓度为 1%；每 24 h取样，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行 12%SDS分析. 对 GS115 和 GS115 /pPICZaA 作同样的处理，以便于下游 SDS PAGE的分析 6 、重组蛋白的鉴定与分析——6.1 Western blotting 将丙酮沉淀后上清→12%聚丙烯酰凝胶电泳→转移至硝酸纤维膜→1% BSA 封闭硝酸纤维膜→依次加入一抗（Aβ42 抗体）和二抗（羊抗小鼠 HRP 标记 IgG）， TBST 洗涤 5 次，HRP-DAB 底物显色试剂盒显色. Western Blot 原理 a Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 Western Blot 原理 b 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 Western Blot 原理 c 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影