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动物细胞培养技术－2 （一）常用的培养方法 悬滴培养Hanging－drop cultivation 培养瓶培养 旋转管培养Rotate tube cultivation 克隆培养法Cloning culture technique 细胞同步化培养 动物细胞大规模培养 （1）原代培养与传代培养 取材 2 原代培养——组织块培养 3 传代培养——消化法 一般传代培养的步骤 (1)? 吸出培养瓶内旧培养液。 (2)? 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 (3)? 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细 胞质回缩现象，终止消化。 (4)? 吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以 免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 (5)? 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。 （二）建立细胞系过程 肿瘤细胞的体外培养与建系过程 以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程： （1）取材 食管癌患者的手术标本 （2）原代培养 1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小 时。 2）? 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。 3）? 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 养液，继续培养。 （3）建系过程 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。 用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为ECA109。 ECA109 经生物学特性分析后确定细胞系建立成功 建立细胞系的要求 国际上对Certified cell的确定尚无统一标准 1 组织来源 2 细胞生物学检测：形态，特异结构，细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特异性如腺细胞，肿瘤细胞 3 培养条件和方法 （三）细胞系和细胞株鉴定 鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性，污染情况 鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长曲线，计算分裂指数，染色体组型和带型分析，同工酶酶谱检测 档案资料及管理使用：美国标准细胞库ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰老细胞库CAR 细胞计数 四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左线和上线边的细胞。 细胞密度个/ml＝平均细胞数x10^3x稀释倍数 2. 台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104 细胞/孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养板每孔容积370ul），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2mg／ml的MTT液（50ul／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150ul／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm），记录结果，绘制生长曲线。 （四）细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 1 预先配制冻存液： 含20%血清培养基 1