微免试验课教案.docVIP

厦 门 大 学 医 学 院 教 案 首 页 题 目 凝集反应、沉淀反应 学时 4 √□理论课□实验实习课 √ 教 学 对 象 2006级临床 上课日期 2008年6月19日1 上课地点 生化大楼204 目 的 要 求 掌握凝集反应的原理、分类及临床应用 掌握沉淀反应的原理、分离及临床应用 掌握玻片凝集和试管凝集的操作方法； 了解玻片凝集和试管凝集的应用； 熟悉单向琼脂扩散的操作技术； 掌握测定结果的计算方法。 重 点 难 点 抗体梯度稀释的方法； 判断抗体效价的方法。 无菌操作技术及静脉采血 参 考 资 料 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编； 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。 习 题 作 业 加样时如何防止“跳管”？ 加细胞抗原时为何从第七管开始依次向前加样？ 教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计 讲解实验室规则及实验分组、实验课考核标准 15分钟 讲解凝集反应、沉淀反应的原理、分类、临床应用 30分钟 颗粒性抗原，如完整细菌和细胞等与相应抗体在适量电解质存在条件下，形成肉眼可见凝集物，称为凝集反应（agglutination）。凝集反应分为直接和间接两种。直接凝集反应是指颗粒性抗原与相应抗体直接结合而出现凝集。间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于与免疫无关的载体颗粒表面，然后与相应抗体（或抗原）反应而出现凝集。根据吸附抗原或抗体载体不同，分别有不同的名称。如血凝试验、乳胶凝集试验、协同凝集试验等 讲解试管凝集反应的原理、操作方法并示教 30分钟 试管凝集反应：(90min) 原理：试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，经过一定时间后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。 方法： 1.无菌取外周血1ml(无须抗凝)，快速加入7ml生理盐水中混合均匀， 1200rpm/min离心10min,弃上清，以生理盐水反复洗涤2次，量取红细胞容积，加适量生理盐水配制成0.5%人红细胞悬液。 2.取清洁小试管14支，分两排依次排列于试管架上，并标明管号。各管均加生理盐水0.5ml。 3.分别用1ml吸管吸取1:10稀释抗“A”和抗“B”诊断血清0.5ml 加入第1管中，于管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀。 4.然后吸取0.5ml注入第2管中，再于第2管连续吸吹三次后吸取0.5ml注入第3管，依次类推。稀释到第6管，在第6管吸出0.5ml弃取。自第1管至第6管血清稀释倍数依次为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，第7管不加血清作为红细胞对照，稀释方法见图1-2-1。 5.用2ml吸管吸取上述0.5%人外周血红细胞悬液，从第7管向前依次滴加各管，每管0.5ml。此时血清稀释倍数增加了一倍。 6.将各管振荡混匀，置于室温，1h后观察结果。 抗体梯度稀释的方法：(20min) 判定抗体效价的方法：(20min) 讲解具体的实验方法及分组 (20min) 学生实验 (30min) 二、玻片凝集反应 (40min) 讲解ABO血型鉴定的方法，然后分组实验，每人检测自己的血型 (40min) 原理：玻片凝集反应是将已知抗体与未知颗粒性抗原物质(如红细胞、细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。 此法属定性试验，方法简便快速，常用已知抗体检测未知抗原。 方法： 1.消毒耳垂或指尖，针刺取血1-2滴放入装有0.5ml生理盐水试管中混匀，制成血细胞悬液。 2.取载玻片1张，分成两格，一格标记为“A”，另一格标记为“B”。“A”侧加抗A血清（含A抗体），“B”侧加抗B血清（含B抗体），各一滴。 3.在两侧各加一滴血细胞悬液，混匀，3-5 min后观察结果。 三．讲解间接凝集反应的原理 可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的微球载体上，形成致敏载体（免疫微球），再与相应抗体或抗原在电解质存在的条件下进行反应，产生凝集，称为间接凝集反应。 四、双向琼脂扩散实验 (50min) 讲解琼脂板打孔得方法及该实验的操作原理及具体操作步骤 (30min) 原理： 可溶性抗原与相应抗体在适量电解质存在的情况下，形成肉眼可见沉淀物，称为沉淀反应（precipitation）。参与反应的抗原为沉淀原，抗体为沉淀素。由于抗原多为胶体溶液，为求得抗原与抗体适当比例，操作时一般需稀释抗原。沉淀反应种类很多，有环状沉淀法、絮状沉淀法、琼脂凝胶扩散法和免疫电泳等，在此重点介绍琼脂凝胶扩散法。 含水分的半固体琼脂凝胶如同网状支架，允许可溶性抗原与抗体在其间