FISH实验技术一、技术原理.PDFVIP

FISH实验技术 一、技术原理 FISH技术是利用特异的DNA探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检 测细胞进行DNA- DNA原位杂交，并用荧光法显示。是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果 迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分 裂像、冰冻切片和石蜡切片。 二、试剂配制： 2.1变性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺。每次新鲜配制。 2.2杂交后洗涤液： 20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。 三、实验步骤 1准备切片 标本需在10%的中性福尔马林固定24-48小时，切片厚度为4- 5um，直接晾干，将玻片烤过夜,温度56-70℃。 2脱蜡 用钻石笔标出杂交区域 ，将切片浸入二甲苯中,10分钟×3次，室温 ，用100％ 的无水乙醇脱水，5分钟×2次 ，室温干燥，或在45- 50℃的烤箱烤干，约2－5分钟。 3 蛋白酶处理 3.1每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 3.2 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。 3.3 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。 3.4梯度酒精脱水（-20℃预冷），空气中干燥。 4变性 4.1每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； 4.2 78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 4.3 78℃孵育8 min； 4.4 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2 min； 4.5 空气干燥。 5 杂交 5.1准备探针； 5.2 取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 5.3 滴10 μl 探针在切片的组织上，加盖玻片； 5.4 盖上湿盒盖，37℃孵育12-16 h。 5.5杂交后水洗 5.5.1 镊子小心去除盖玻片； 5. 5.2 43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min； 5. 5.3 2×SSC（37℃）洗两次，每次10 min； 5. 5.4 切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 5.6检测 5.6.1 从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内， 同时处理4张切片。 5.6.2每张切片使用30-60 μl 罗丹明抗- 地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20 min； 5.6.3去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每 次2 min。 扩增： 5.6.4从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 5.6.5每张切片滴30-60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min； 5.6.6去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每 次2 min； 5.6.7从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 5.6.8每张切片滴30-60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min； 5.6.9 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。 6 细胞核染色 6.1 张切片加10-20 μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2-5 ml； 6.2尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在- 20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。 7 计数 按一定方向移动玻片，计数细胞核内的信号。同一个细胞内，计数荧光点大小 相近的信号，两个荧光点之间的距离小于等于信号直径的只能计数一个信号。 核外的信号以及只有一个颜色的细胞都不能计数。计数核内每个颜色的信号一 个或一个以上的细胞。