三章荧光分光光度法.ppt

d. 试样量少且方法简便 采用荧光微池，只要用10 ?L试液即可。 e. 能同时提供较多的物理参数 包括：激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光 总量、极值峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命 和荧光偏振等参数。 （2）注意事项 a. 溶剂和化学试剂 对于溶剂，一是选择要适当，二是要足够纯。 在使用波段范围内，选用的溶剂应无吸收才好；另 外溶剂中也不应含有卤素、硝基化合物等，否则会 降低荧光强度。 对于化学试剂，越纯越好。 引起荧光熄灭的原因很多，机理也很复杂。下面讨论几种导致荧光熄灭的主要类型。 （a）碰撞熄灭 碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。 它是指处于单重激发态的荧光物质分子M*与 熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁 方式回到基态，因而产生荧光熄灭作用。 　 碰撞熄灭的定量方程： F0/F-1=k[Q] 上式称为：Stern- Volmer方程式。 式中：k为熄灭常数；[Q]为熄灭剂浓度，单 位mol?L-1；F0、F分别为熄灭剂不存在时和存在时， 溶液的荧光强度。 ?）熄灭常数（k）与体系的粘度有关系，粘度越 大，k越小； ?）熄灭常数（k）与体系的温度有关系，温度升 高，k也升高；温度每升高1 ?C，k值增加在2 %以 下； ?）熄灭剂的浓度[Q]不得大于10 mol?L-1。 （b）组成化合物的熄灭 　　有些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论来解释。 例如：某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后， （*）溶液的吸收光谱有了显著的改变； （*）溶液的荧光强度显著降低。 又如：某些荧光物质的溶液在加入熄灭剂之后， 它的荧光强度随着温度的升高而增强。 以上几种情况都是因为组成化合物的熄灭所致。 上述情况可能是： 络合 M + Q ? MQ （有荧光） （无荧光） 分解 MQ ? M + Q （ T?，荧光增强） 如果MQ的形成是由于强大的力，则MQ将具 有它自己的特征吸收，因此溶液的吸收光谱也发生 了改变。 （c）转入三重线态（级）的熄灭 　　含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化 合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物， 容易转入三重线级，溶液中绝大部分转入三重线级 的分子在一般温度下不发光，它们会将多余的能量 消耗于它们与其它分子的碰撞之中，因而引起荧光 熄灭。 　　　 　 溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可 能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光 物质分子相互作用，促进形成顺磁性的三重态荧光 分子，即加速系间窜跃所致。 实验证明：O2的熄灭作用，似乎是随着溶剂的 介电常数的减小而增加，所以O2在水溶液中熄灭作 用较小，而在有机溶剂中熄灭作用较强。 （d）发生电子转移反应的熄灭 　 某些熄灭剂分子与荧光物质分子相互作用时， 发生了电子转移的反应，即：氧化-还原反应，因而 引起荧光的熄灭。 例如：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭 D* + Fe2+? D- + Fe3+ 　　　 有荧光 　 无荧光 　　　 发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离 子；I-， Br-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎 宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生 熄灭作用。 （e）荧光物质的自熄灭 　　荧光物质溶液的浓度大于1g?L-1时，常常会发 生自熄灭现象，所以液态纯物质的荧光一般都不强 烈。 此种熄灭的原因：?）由于浓度大，分子碰撞 几率大，因而引起能量损失大；?）溶液浓度过高， 物质分子发生二聚体乃至多聚体，这些多聚体不发 光。 　 综上所述： 无论何种类型的熄灭作用，均随熄灭剂浓度 的增加而增大。 如对试液进行稀释，则可消除或降低荧光的 熄灭作用。但是O2的熄灭作用并未消除，需在试 液中通入N2或CO2等以驱逐O2，方可达到消除熄 灭作用的目的。 （6）光散射 　　光散射常常关系到一个实验的灵敏度和再现性。 实践中常常遇到的光散射包括：溶液的瑞利散 射、拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射（丁铎尔 散射）。 　　　 　 当物质分子吸收了频率较低的光能后