生化与分子生物实用技术课.pptVIP

分子生物学实验技术总体设计 时间：周二 8：30~10:00 地点：309室 内容：讲授： 1.重组DNA的实验方案 2.相关概念 3.目的基因的获得——cDNA mRNA 提取、PCR(酶切位点） 实验：上午 1.mRNA 提取 2. PCR 下午 3. 电泳(分组操作） 时间：周三 地点：309室 实验：上午 1.PCR产物纯化回收（分组操作） 2.酶切（分组操作） 3.电泳 4.切胶回收 下午 1.连接 2.转化（分组操作） 时间：周四 地点：309室 实验：下午：质粒提取（分组操作） 酶切电泳（略） 主要知识点：基因重组的概念及过程；用于重组DNA技术的理想载体应该具备的特点；获得目的基因的途径；真核表达体系的优点；常用真核细胞转染方法的种类；RT-PCR的基本实验步骤（包括PCR）；限制性内切酶的特点 重组DNA技术  Recombinant DNA Technology 载 体 定义： 能够携带外源基因并且具有自主复制能力的DNA,是将目的DNA导入受体细胞的工具。 具有自主复制能力，保证重组DNA分子可以在宿主细胞内得到扩增； 具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯； 具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等），便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆； 分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源DNA； 具有较高的遗传稳定性； 使用安全。 载体种类 目的基因的获取 1. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5.从已有重组载体中获得 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction  以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3 ′末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。这一过程成为PCR。 重组DNA技术的基本过程及技术路线 分-获取目的基因 切-限制性内切酶 接-连接目的基因及载体 转-重组子转入宿主细胞 筛-筛选出含有重组子的宿主细胞 mRNA 提取 凝胶中回收PCR产物 质粒的提取 以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例 一、PCR扩增得到Akt1/PKB的cDNA 设计基因特异性引物a、b，以克隆在质粒pCIS2-Akt1上的Akt/PKB cDNA为模板5 ?端引入HindⅢ酶切位点，3’引入BamHI酶切位点，以a、b为引物，扩增野生型Akt1/ PKB。 引物a(划线部分为HindⅢ酶切位点)： 5′-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3′ 引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： 5′-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3′ PCR产物末端限制酶切位点的切断情况 10×PCR反应缓冲液 5.0 ?l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 ?l Ex Taq DNA聚合酶(5U/?l ) 0.25 ?