PCR技术基本原理和实际应用研究生课程.ppt

五、几种重要的PCR衍生技术 12、巢式PCR（nest PCR） 13、差异显示PCR（differential display ）  --------------------------- primer --------------------------- ↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓ 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 . 病 例 21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L) 其余指标均正常 在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在 48-85 U/L之间 经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。 LDH-B基因变异类型 ?变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响 ?B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化 B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合 B-103 8bp重复 移码突变 B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合 B-139 丢失2 bp (TC) 移码突变 B-145 4bp重复 移码突变 B-147 TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变 B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基质结合