遗传学实验设计 巴特 13301050238.docx

遗传学实验实验设计： 实验思路 实验（1）： 运用免疫细胞化学原理，将B基因表达产物B蛋白的特异性抗体B抗体作为一抗，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，之后再用链霉亲和素等的抗生物素与二抗结合，最后通过显色反应或荧光来显示心肌细胞中的B蛋白，在光学显微镜或者荧光显微镜下观察显色变化，藉此对心肌细胞中B蛋白作定性、定量的检测。本实验中使用链霉生物素—生物素—过氧化物酶复合物技术（SABC技术）。 实验（2）： 基本原理与实验（1）相同，都是利用免疫细胞化学法原理，都是将蛋白质含量变化转化为显色变化来进行判断，故而可以在同一组实验中得到验证。在实验（1）的基础上，可以再增加一组加A药的心肌细胞模型，原理如下：如果B蛋白参与了A药保护心肌细胞的过程，那么相对于没有加入A药的缺血损伤组，B蛋白的数量会发生相对变化，如果B蛋白的量没有发生这种相对变化，则B蛋白没有参与这个过程。实验中还要设置加A药的正常组，以防止A药可能导致的其他对于B蛋白的影响（刺激B蛋白分泌等）干扰实验并造成实验结果的偏差。 实验试剂和用品 仪器：移液枪及相应枪头、滴管、显微镜、湿盒 材料：培养的心肌细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAb、0.3%H2O2-PBS、适宜的培养液、蒸馏水。 实验步骤 1，取部分培养的心肌细胞，接种于96孔板中，每组正常、缺血损伤、加A药缺血损伤、加A药正常各三孔，接种之后对所有损伤组进行缺血损伤处理，并在加药组加入A药物。 2，间隔合适的培养时间之后取之前培养的心肌细胞（之后的实验步骤对于每个孔都要相同）——吸弃培养液，PBS洗3次——甲醇固定5min——PBS洗3次（轻摇后吸弃，之后相同）——加入封闭液25μL，37℃，30-60min，吸去上清液——加一抗（B抗体）25μL，37℃，1-2h后置4℃冰箱过夜——PBS洗3次——加二抗25μL，37℃，1-2h——PBS洗3次——加0.3% H2O2-PBS（30-50μL），37℃，30min——PBS洗3次——加SABC工作液（即用型）25μL，37℃，30min——PBS洗3次——DAB显色：用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板，每孔25μL，显微镜下控制，用蒸馏水终止反应——观察各组在镜下的显色结果。 可能的实验结果与讨论 1，通过实验可以观察到B蛋白的显色，所以可以通过染色的深浅变化来判断B蛋白在各组细胞中的含量变化，如果缺血损伤组与正常组的染色程度相同，则证明B基因的表达产物与心肌缺血之间没有明显的关系，如果有变化则证明这两者之间存在着某种关系。 2，对比加A药缺血损伤组和缺血损伤组中染色的差异（通过加A药正常组来去除A药对于B基因表达产物B蛋白含量的影响），如果这两者之间染色是相同的，则证明B蛋白没有直接参与到A药的作用当中，如果两者的染色存在着差异，则证明B蛋白参与到了A药物治疗心肌缺血的过程当中。