遗传学实验设计.docx

已知：（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变 试通过设计细胞生物学实验明确： （1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？ （2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 实验目的 通过实验确定B基因的表达产物与心肌缺血之间的关系。并验证，在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 实验原则： 1.对照原则：除了Control组和缺血组之间的对照之外，相同组之内也要进行对照，因此每种检测方法都取相同组内各3组进行检测，以其平均水平分析实验结果。 2.随机原则：本实验设计尽量减少了外在因素和人为因素的干扰，遵循随机原则。 3.重复原则：该设计可以在相同实验条件下做多次独立重复实验。一般认为重复5次以上的实验才具有较高的可信度。 实验原理： 已知在心肌细胞缺血过程中，B基因的表达产物量会发生改变，使用B基因表达蛋白的特异性抗体一抗，假定存在某二抗可以结合到一抗。 利用免疫细胞化学方法对其B基因表达产物进行检测——利用B基因表达产物的一抗、含有标记生物素的二抗进行反应，生物素再与标记HRP或AKP等的抗生物素结合，最后利用DAB染色的方法进行显色，在光学显微镜下通过显色反应显示细胞中B基因表达产物的情况从而进行定量分析B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系。同时当二抗结合到一抗之后，在显色液的作用下发生显色作用，用酶联免疫检测仪在某一波长下测定其吸光值，可以定性的反映B基因的表达蛋白的量于心肌细胞缺血之间的关系。 A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用，若要检验A药物在保护其免受缺血损伤时B基因表达产物参与其中，则可以通过检测B基因表达产物量的改变进而验证 实验试剂与器材 仪器：酶联免疫检测仪，培养细胞（96孔细胞培养板），光学显微镜，移液枪，枪头 试剂：甲醇、PBS、一抗、二抗、显色液、封闭液 SABC、DAB 、0.3％H2O2-PBS 实验步骤 （1）验证：B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系 1.心肌细胞原代培养 取用新生乳鼠的心肌细胞，经过消化、收集、培养之后进行计数，调整细胞浓度之后接种于96孔板，设置若干孔，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，隔日换液一次，进行如下实验。 2. 心肌细胞Control-缺血组的对比模型建立 取原代培养的细胞于96孔板，并进行分组，分为Control组、缺血组，每组10个平行孔，放置于37℃、5%CO2培养箱中对细胞进行培养24h（使得细胞处于对数生长期）。24h后弃去两组的培养液，之后在Control组中加入正常剂量含血清的培养液继续培养，同时在缺血组中加入不含血清的相同量的培养液继续培养24h并进行一系列后续操作: 酶联免疫检测仪检测 免疫细胞化学 1. PBS洗，2次 ，3min/次 2.甲醇固定6min 3.PBS洗，3次，3min/次 4.加入封闭液, 25μl，37 ℃，30min 5.吸弃上清液；加一抗（1:300）25μl，37 ℃，1~2h，4 ℃过夜 6.PBS洗3次，3min/次 7.加二抗25μl，37 ℃，1h以上 8.PBS洗，3次，3min/次 9.加入显色液，镜下控制，蒸馏水终止反应 10.在某一波长下用酶联免疫检测仪测定五组吸光度 1. PBS洗，2次 ，3min/次 2.甲醇固定6min 3.PBS洗，3次，3min/次 4.加入封闭液, 25μl，37 ℃，30min 5.吸弃上清液；加一抗（1:300）25μl，37 ℃，1~2h，4 ℃过夜 6.PBS洗3次，3min/次 7.加二抗25μl，37 ℃，1h以上 8.PBS洗，3次，3min/次 9.加0.3％ H2O2-PBS（30-50μl），37 ℃，30min 10.PBS洗，3次 11.SABC工作液（即用型）25μl，37 ℃，30min 12.PBS洗，3次 13.DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）：用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板（25μl/孔），镜下控制，以蒸馏水终止反应。 观察结果 分组 培养液血清含量 Control组 正常剂量的血清 缺血组 不含血清 3. 心肌细胞B基因表达产物检测 取以上Control组与缺血组模型的心肌细胞，利用免疫细胞化学法对其B基因表达产物进行检测——即利用B基因表达产物的一抗、含有标记生物素的二抗进行反应，生物素再与标记HRP或AKP等的抗生物素结合，最后利用DAB染色的方法进行显色，在光学显微镜下通过显色反应显示细胞中B基因表达产物的情况。 取以上Control组与缺血组模型的心肌细胞在在某一波长下用酶联免疫检测仪测定两组吸光度。 4. 定性分析 通过显色反应显示细胞中B基