基因克隆载体质粒.pptVIP

3.pBR322质粒载体 “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。 (Tetr) pBR322的构建： 为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力） pBR322的结构来源 * 第四章 基因克隆的载体 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 基因重组步 骤 图解 载体（vector）是指能携带外源基因进入宿主细胞的运载工具。 早期：质粒、病毒、噬菌体 新增：人工微小染色体、 YAC载体 作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能： 1、具备自主复制的能力；即能独立于染色体而进行自主复制； 2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因插入； 4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域，插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控制性扩增。 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 环状 动物细胞 和细菌 穿梭载体 SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 环状 动物细胞 病毒载体 〉 1000 kb 线性染色体 哺乳类细胞 MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 100 - 2000 kb 线性染色体 酵母细胞 YAC (Yeast Artificial chromosome ) PCYPAC1 100 - 2000 kb 环状 E.coli PAC (P1-derived Artificial chromosome) Pel oBAC系列 ≈300 kb 环状 E.coli BAC (Bacterial Artificial Chromosome) pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV 35- 45kb 环状 E.coli 粘粒载体 M13mp系列 〈 10 kb 环状 E.coli 丝状噬菌体及噬菌粒 EMBL系列， Λ gt系列 9 - 24kb 线状 E.coli λ噬菌体 pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 〈 8kb 环状 E.coli 举例 插入片断 结构 受体细胞 质粒* 载体的种类和特征 第一节 质粒（plasmid）载体 一、质粒定义与其基本特征 二、质粒的类型 三、质粒的构型（存在形式） 四、质粒的命名规则 五、质粒的不亲合性 六 、质粒DNA的分离与纯化 七、重要的大肠杆菌质粒载体 一、质粒定义与其基本特征  质粒（plasmid）是一种独立于染色体外的能自主复制的共价、闭合环状双链DNA分子。 主要存在于细菌中，在霉菌、酵母及动、植物细胞中也发现有。 大小1~200kb，约103~105kD； 目前用作载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的。 　 质粒（plasmid） 常 有1 ~ 3个抗药性基因，以利于 筛选。 二、质粒的类型 （一）根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类： 　　F质粒：又称F因子、性质粒，可转移基因到新受体细胞； 　　R质粒：含有青霉素或四环素等抗性基因；AmpR（氨苄青霉素抗性）、TetR（四环素抗性）。 　　Col质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的ColE1。 降解质粒:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。 　　致瘤质粒：农杆菌Ti质粒 （二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 　　 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 　　 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒 　　 （三）根据质粒的复制特性分为两大类： 　　 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒，每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细胞中存在的数目。 　　 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， 20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。 　　 三、质粒的构型 （存在形式） L构型：线性DNA（线状双螺旋） OC构型：开环DNA（开环双螺旋） SC构型：共价闭合环形DNA （cccDNA）