溶解曲线问题.docVIP

问题：融解曲线前端不太正常。 1：融解曲线形成原理 融解曲线是不断升温至95℃过程中采集的荧光值。也就是说在不同温度条件下，DNA进行解链， \t /experiment/_blank 荧光染料从双链中游离出来，从而出现荧光值的降低。但是当温度达到DNA解链一半的温度时，也就是Tm值时， \t /experiment/_blank 荧光染料会大量游离出来，从而使荧光值迅速降低，最后转换成导数后形成高峰。 利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而区分非特异性扩增。 图一：纵坐标为将荧光强度的变化对温度的变化求导。（-dI/dT) （融解曲线呈单一峰时，表示无非特异性产物，荧光定量准确） 2：融解曲线的两种不同形式 图二 对图二曲线每一个位置求导，负导数（-dI/dT）作为纵坐标，得到图三： 图三 3：红色框位置曲线解释 图四 融解曲线的采集过程中，温度的变化为每0.05s上升0.3℃，buffer成分（Tris-HCl）随着温度的上升，pH降低，导致SYBR Green 的荧光信号强度降低。因此在68℃-75℃度之间，虽然没有DNA双链解开，但是荧光信号发生降低。 温度在65℃-68℃之间（红色框框位置），虽然温度逐渐上升，但是荧光信号强度不变，可能的原因是： 虽然温度上升，pH值降低，但是如果pH值依旧在SY