鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验.docVIP

鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 （一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。（四）实验步骤： 一、血凝试验（HA） 取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。 孔 孔 号 滴 度 材 料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 对照 PBS（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ 1:5稀释抗原（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 1%鸡红细胞悬浮液（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 作用时间及温度 37℃ 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。6、室温静置10-30分，观察结果（见下表）； 孔 孔 号 滴 度 材 料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒对照 血清对照 PBS（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ 阳性血清（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 弃去 0.25 4单位病毒（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 作用时间及温度 37℃ 1%鸡红细胞悬浮液（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 作用时间及温度 37℃静置30- 7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。以待检血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释倍数为血清的HAI效价，用2n表示。通常能使4个凝集单位病毒凝集红细胞的作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为抗体的血凝抑制价（HI效价）。只有阴性对照孔血清滴度不大于21g2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。