微卫星DNAPCR扩增结果示例.pptVIP

对照 实验 等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR) 利用末端突变的引物进行PCR。 实际应用中，常使用三个引物： A3’ 5’ G3’ 5’ 5’ 3’ 正常上游引物 正常下游引物 突变上游引物 使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。 使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。 （严格条件下的PCR） O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH 脱氧核苷酸的连接 DNA测序 O 碱基 C P O H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 H2O 脱氧核苷酸的连接 O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH X 双脱氧核苷酸… ? 四套反应体系 1--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP 2--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP 3--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP 4--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP ATGCGGTACCAT 5’ 3’ 测序模板 5’ TA 5’ TACGCCA 5’ TACGCCATGGTA C C C 第一套反应 第二套反应 5’ 5’ 5’ A C G T A T G G T A C C G C A T DNA自动测序 荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH) 利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光素偶联得抗原-抗体检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。 标记物：脱氧尿嘧啶三磷酸 Bio-11-dUTP(生物素) Dig-11-dUTP(地高辛) 标记方法：缺口平移法，随机引物法。 荧光标记原位杂交原理示意图 染色体FISH探针 整条染色体涂染探针 染色体重复序列探针 染色体专一位点探针 基本过程： 1、染色体标本制备 2、探针制备 3、杂交 4、显微观察（染色体分带） 整条染色体涂染 通过整条染色体涂染判断易位染色体 * NTMCGenetics * 基 因 诊 断 Gene Diagnosis 谭湘陵 南通医学院生物技术系遗传学教研室 基因诊断的概念— 直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检测，从而辅助临床进行的诊断。 基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊断技术，它依托DNA重组技术，从基因型入手，诊断表现型。（逆向诊断） 基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状细胞贫血病的产前基因诊断。 基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊断方法。 由于基因诊断的发展时间还不长，人类对基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依赖于传统的方法，但随着分子遗传学、分子生物学，特别是人类基因组计划的完成，基因诊断将显示出强大的生命力。 传统的诊断（举例）： １、问、望、听、触???经验型诊断 ２、化验/检验—材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。 ３、影像学—X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。 ４、特殊检查—染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。 在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。 这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测也就是说“发病”了才能诊断。 基因诊断的对象 1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病 2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症 3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证 遗传标记 1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 8kb 5kb 3kb 在个体和群体中，片段长度表现出多态性。 如3kb, 5kb, 7kb, 8kb… RFLP呈现孟德尔式遗传。 常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。 产生多态性的原因是内切酶位点的变化。 原位点的消失；新位点的产生。 GAATTCCTTAAG GATTTCCTAAAG 1 2 1 2 I II 2kb 3kb 5kb 7kb 2、第二代遗传标记—微卫星DNA(Micro-satellite DNA) 属高度重复