基因研究技术汇总.ppt

6 分子生物学研究方法(下) 6.1 基因表达研究技术 6.1.1 基因表达系列分析技术 概念： 以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术 原理： 用锚定酶和标签酶两种限制性内切酶切割DNA分子的特定位置(靠近3端)，分离出短核苷酸序列(9～lObp)。它包含了该转录本的足够信息。将一个体系的所有转录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测序．便可以得到该体系的所有转录本的表达情况。 操作步骤 以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA，以一种锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）进行酶切后，收集其cDNA的3‘端部分。 将收集的3’端cDNA等分为两部分，分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组成。 连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5突出端，得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50个碱基）。混合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100个碱基的双标签体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。 用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体（约26个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体，克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。 对测序得到的标签数据进行分析处理。 6.1.2 RNA的选择性剪接技术 概念 是指用