细胞培养入门技术.pptVIP

吸去旧液 加入消化液 解离细胞约2min 在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状 细胞的传代培养：贴附型 PBS洗 涤 1~2次 吹打悬浮细胞 调整细胞密度 分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养 在培养瓶中加入 适量含血清培养液 培养细胞 的观察 中止消化、吹散细胞 细胞计数，调节密度 细胞的传代培养：悬浮型 直立瓶 去旧液 加新液 分瓶接种 加新液 无菌操作注意事项 无菌操作中的注意事项 ??? 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存盒 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 1预先配制冻存液，避免因临时配制产热而伤害细胞 配方： 含血清培的完全培养基 5% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存洁率可达80％以上。 细胞复苏方法 （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠 2台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力 3 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 验、肿瘤放射敏感性实验等。 操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡1