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重组DNA技术所需的基本条件 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 第一节 限制性核酸内切酶 宿主细胞的限制和修饰现象 限制性核酸内切酶的发现及类型 限制性核酸内切酶的命名 Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 影响限制性核酸内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶的星活性 甲基化酶及其基本特征 仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage对λ (K)进行了修饰。 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用：实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用：宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII 和Hind III 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用 。 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 2 限制性核酸内切酶的发现及类型 3 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 4 Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 4.1 II型限制性核酸内切酶的识别序列及切割方式 识别位点 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR I的切割位点 EcoR I的识别位点 5`… GCTGAATTCGAG…3` 3`… CGACTTAAGCTC…5` 4.2 同裂酶与同尾酶 同裂酶(isoschizomers):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 例：Sma I和Xma I(CCCGGG)。 同尾酶(isocaudamer):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。 例：BamH I(GGATCC))和Bgl Ⅱ(AGATCT)。 5 Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 5.1 标准酶切体系的建立 大部分II型限制性核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCL 50mM pH7.5 MgCL2 10mM NaCL 0-150mM DTT 1mM Volume 20-100ul T T 37℃ 1-2.5h 1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1ug标准DNA所需的酶量 1) 将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18uL。 2) 加入2uL适当的10×限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁混匀。 3) 加入1～2单位限制酶，轻弹管外壁混匀。 4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 5) 反应终止 II型核酸内切酶的多酶联合酶解： 当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。 若没有通用缓冲液时，使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 II型核酸内切酶酶切反应的终止 65 ℃，温浴5分钟（常用） 加入终止液（如EDTA） 加入等体积的酚，抽提酶解产物 5.2 Ⅱ限制性核酸内切酶对DNA分子的不完全酶解 减少酶量； 增加反应体积； 缩短反应时间； 降低反应温度； 5.3 Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。 整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 6 影响限制性核酸内切酶活性的因素 6.1 DNA样品的纯度