线粒体COI基克隆.docVIP

线粒体COI基因的分子克隆 一、试剂材料 1、500一800克重的活鲤鱼和1500一2500克重的活草鱼 各五条 2、STE缓冲液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris·HCI，1mmol/L EDTA，pH8.0) 1L 3、STM缓冲液(0.25mol/L蔗搪，10mM Tris·HCl，0.5mmol/L Mgcl2，PH8.0) 50mL 4、DNasel 2mg 5、0.5mol/L EDTA pH8.0 10mL 6、NTE缓冲液(20mmol/L NaCI，20mmol/L Tris·HCI，lmmol/L EDTA，pH8.0) 50mL 7、20% SDS 8、苯酚 50ml 9、3mol/L NaAC (pH 4.8) 5mL 10、冷乙醇(100%) 50mL 11、95%乙醇 200Ml 12、TE缓冲液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH8·0)， 10mL 13、10mg/ml DNA一freeRNaseA溶液（溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为 10mg/mL，煮沸10～30min, 除去DNase 活性，-20℃贮存） 40ul 14、氯仿:苯酚:异戊醇 (Vl:V2:V3为 24:24:l) 49ml(24+24+1) 1、引物1 、引物2 2、 10×PCR 缓冲液（ Buffer ） 3、 2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4、Taq酶 5、琼脂糖：1.0%； 6、电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml） 7、溴化乙锭EB：5 μl / 100 ml 8、溴酚蓝指示剂 14、限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind II、Hind III和Pst l， 16、氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g，NaCl 10g ，加水 至1000ml , 若配置固体培养基，则再加入15g?Agar(琼脂) 。） 17、pUC19质粒DNA 19、杆菌HB101菌株， 20、感受态细胞HB101。 二、工具材料 1、剪刀 5把 不同大小 2、镊子 5个 不同大小 3、烧杯 2个大的 4个小的 4、移液管 （一般用移液枪） 5、离心管 10个最大的 6、培养皿 5个小的 10个大的 7、三角锥瓶 4个 6、定容瓶 2个50 m L 1个1L 7、试管架 1个 三、设备材料 1、高压灭菌锅 2、无菌操作台 3、冰箱 4、水浴锅 5、离心机 6、玻璃匀浆器 7、凝胶电泳系统 8、紫外透射检测仪 9、PCR仪 9、缺口转译标记试剂盒， 10、质粒DNA限制酶消化分析及杂交探针系统 11、硝酸纤维素滤膜 13、同位素P32 标记的水稻线粒体Col探针 紫外透射检测仪 四、实验步骤 （一）鱼肝线粒体DNA 的分离与纯化 1、按上面所写准备实验材料 2、对实验器材灭菌 3、对鱼预处理 刮鳞 消毒 取鱼肝用STE缓冲液清洗 4、再加入STE缓冲液到 玻璃匀浆器 里冰浴中缓和匀浆 5、离心 转头在3000g 离心 30分钟 6、除去上层脂肪和管底细胞碎片 取上清液 继续离心 20000g 离心30分钟 得到粗提的线粒体沉淀。 7、加入20ml STM缓冲液 2mgNasel 25℃水浴中保温消化30分钟 8、取 0.8ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 溶液加到消化液中，使终浓度为20mmol/L，终止酶解 反应。 9、然后再加入160ml STE缓冲液，20000g下离心20分钟，收集线粒体沉淀，重复用STE缓冲液漂洗线粒体二次，清除污染的核DNA 10、把离心所得的线粒体沉淀悬浮在20ml的NTE缓冲液，加入20% SDS溶液 至终浓度为0.8%，放置在37℃水浴中保温10分钟。 11、用等体积的苯酚抽提脱蛋白二次，留水相， 12、用10分之1的 3mol/L NaAC 和二倍体积的冷乙醇(100%)，混匀后放在一20℃冰箱中沉淀过夜。 13、离心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE缓冲液, 加入40ul(10mg/ml)的DNA一free RNaseA溶液 置37℃水浴中保温60分钟。 14、消化液再用氯仿:苯酚:异戊醇 抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并将离心收集的mtDNA经真空干燥后，溶于适量的TE缓冲液中，贮于