共聚焦操作流程.docVIP

FV1000激光共聚焦显微镜操作流程 实验环境 观察仪器是否有外表明显损坏，如需开启空调，一般控制在25度。拉上窗帘，避免标本荧光淬灭及杂光干扰。 开机 查看实验记录，确认是否马上能开机（注意：汞灯必须在关机20分钟以后才能再开启，一般为30分钟）。确认后可执行以下操作：（务必先开电源，后开钥匙！！！）。 打开PSU（主电源） 打开激光器（只开启需使用的激光器） 、氩离子多线激光器（458/488/515，应用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等）。 MCPSU半导体综合激光器（LD405应用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635应用染料：CY5/ Alexa647等）。 LD559激光器（注意：电源打开后不要马上开钥匙，等待TEMP指示灯不闪烁后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用）。 打开显微镜电源IX2-UCB 打开荧光汞灯（注意：开启后，“15分钟内勿关”） 打开电脑主机、显示器，登陆windows xp系统，双击共聚焦软件，打开FV10-ASW应用软件。 取图 DIC（微分干涉差）明场立体图 （1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC滑块）。 （2）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，打开卤素灯快门，使用TD滑块（软件TD lamp项）控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦。 1）、使用手控面板选择合适倍率的物镜下观察（注意若用60×油镜时，检偏镜部位要推上弯杆），并检查各物镜对应的DIC元件。 2）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度的调节。（需要时可使用，一般勿调） （3）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，关闭卤素灯快门。打开DIC通道，执行取图操作。 1）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel），size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻找焦平面。 步骤：适当调节HV、gain及offset参数（一般为能看到图像即可），快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击，停止预扫描。 2）、选择AutoHV，放慢扫描速度（扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬灭，一般为10-12.5 us/pixel），size为640by，点击进行再预扫，调节HV、gain及offset参数至图象清晰尖锐即可。点击，停止预扫描。 3）、若背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用）。 4）、点击进行取图，并保存。（注意：原始图像一定要保存为oib格式） 5）、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by），为下一个标本做好准备。 2、荧光图 （1）、拉出检偏镜(DIC滑块)，打开汞灯机械快门（shutter）。 （2）、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦（找视野）。 使用手控面板，根据标本荧光探针选择合适的荧光虑色片及选择合适的物镜下观察，WU紫外激发/蓝色荧光（eg：DAPI），WB蓝色激发/绿色荧光（eg：FITC、EGFP），WG绿色激发/红色荧光(eg:Texas Red，Rhodamine，DsRed)。（一般要求标本在所用的各种荧光探针匹配的荧光虑色片下均能观察到所需视野，eg：DAPI＋FITC+ Texas Red多色荧光探针，需在WU,WB,WG下均能观察到所需视野，DAPI一般荧光较强，FITC或Texas Red下易找些）。（注意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用60×油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆。） （3）、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮，关闭汞灯快门。执行取图操作。 1）、点击，添加荧光染料。（最多为三色，多于三色需分别扫描）若标本使用的荧光染料不是染料库里的染料，可选激发光及发射光谱较接近的染料代替，这时可适当调整 2）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel），size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻找焦平面。 步骤：适当调节HV、gain及offset参数（一般为能看到各通道图像即可），快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击，停止预扫描。 3)、选上（双染以上一定要选上，可避免激发光串色），选择AutoHV （AutoHV功能为自动匹配扫描速度与HV值，不选易造成图像出现强度过饱和状态），放慢扫描速度（一般为10-12.5 us/pixel），size为640by，点击进行再预扫，调节HV、gain及offset参数至图象清晰尖锐即可。点击，停止预扫描。 4）、若背