细胞糖胺多糖（AG）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB）比.docVIP

细胞糖胺多糖（GAG）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法定量检测 试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞糖胺多糖（GAG）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖，与二甲基亚甲基蓝染料结合，在丙醇解离溶液中，释放紫红色染料，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物细胞（皮肤、肌肉、软骨、肿瘤）等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。 技术背景 糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又称为粘多糖（mucopolysaccharide），是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），链接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖与核心蛋白（core protein）共价相联，构成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成为细胞膜和细胞外基质（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于发挥各种不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点，使用异染性（metachromatic）阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性条件下，特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物（Dye-GAG complex），在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪（656nm波长）测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 萃取液（Reagent B） 毫升 染色液（Reagent C） 毫升 解离液（Reagent D） 毫升 标准液（Reagent E） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存 萃取液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 染色液（Reagent C）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 细胞刮脱棒：用于细胞脱离 恒温水槽或干式恒温仪：用于样品反应 微型台式离心机：用于样品操作 比色皿或酶标板：用于比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 一、样品预处理 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化） 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入xx微升 萃取液（Reagent B） 放进一个1.5毫升离心管 强力涡旋震荡1分钟，充分混匀 放进56℃恒温水槽孵育16小时 放进90℃恒温水槽孵育10分钟 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 置于冰槽里备用 二、标准样品配制 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 分别加入xx微升 清理液（Reagent A）到1至5号管 移取xx微升 标准液（Reagent E）到1号管，混匀 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent E）到2号管，混匀 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent E）到3号管，混匀 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent E）到4号管，混匀 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表 管号 清理液（Reagent A） 标准液（Reagent E） 标准糖胺多糖含量 1 xx微升 xx微升 xx微克 2 xx微升 xx微升1号管 xx微克 3 xx微升 xx微升2号管 xx微克 4 xx微升 xx微升3号管 xx微克 5 xx微升 0 0 标准曲线测定 移取xx微升上述配制的 标准液（Reagent E）到1.5毫升离心管 加入xx毫升 染色液（Reagent C） 涡旋震荡15秒 室温下孵