酶联免疫ELISA使用试剂盒检测过程中值得关注的问题.docVIP

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题 ? 1、仪器质控?为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。◎移液器： ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱： 经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机： 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎ 2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。◎特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。◎准确度：通过添加回收实验进行评价。◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。 3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。3.2 振荡提取?将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。②再加入适量的提取剂，重新振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。3.4 浓缩?由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。浓缩方式：?氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。注意：3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。3.5 净化?经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质。将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。?比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃ 4、 酶标分析过程中的注意事项???? 样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。它要求加样的准确性和洗板的一致性。在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。4.1常见加样方式A、吸一打二B、吸二打一?在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：?a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡?b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：A、加样的过程中漏加或者重加；B、加样的过程中忘记更换吸头；C、样本的重加或者漏加；D、忘记记录样本的加样顺序。4.2常见的洗板方式A、洗板机洗板；B、多道孔加样器洗板；C、多孔吸头洗板；?? 在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。4.3 甩板?快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的