细胞融合及体细胞杂交.ppt

实验方法举例 正交实验法: 正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。 响应面分析法: 是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 细胞融合实验.flv 四 细胞融合原理 1细胞膜的结构与功能 细胞膜磷脂分子 扰动出现通道 ——细胞桥 主要环节 （1）亲本选择（单细胞或原生质体制备） （2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附 （3）质膜融合形成细胞桥 P133 图7.4 （4）胞质渗透 （5）细胞核融合 （6）融合细胞筛选 原生质体及其制备 （1）定义： 去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体 （protoplast）。 （2）特点： 无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变 、细胞器转移、细胞融合等操作。 具有全能性，能再生细胞壁。 （ 3）制备与纯化 酶解法的建立 1960年，英国科金第一次采用 酶方法从番茄幼苗大量制备出 原生质体。使植物细胞融合技 术得以建立。 植物细胞的细胞壁主要成分是 纤维素（纤维素微纤丝 Cellulose microfibrils ）、 果胶（pectin）、多糖 （glycan）。 果胶酶、纤维素酶等处理植物 组织，可以破坏胞间层和去掉 细胞的纤维素外壁，得到游离 的裸露原生质体。 4 分离 分离方法 飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 离心法：低速离心，收集沉淀。 结合法：先低速离心，再漂浮 Percoll分层液:是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。 关键： 细胞核的融合 若是没发生细胞核的融合，仅发 生了细胞质的融合，则可能成为 嵌合细胞。 含有多个核的异核细胞合并后形 成的单核细胞称为合核细胞。 细胞核的合并发生在有丝分裂过 程中。但是这种有丝分裂只有当 两个核的DNA合成基本同步时才 能发生：两个核同时进行有丝分 裂，形成一个纺锤体，全部染色 体都排列在一个赤道板上，结果 伴随着细胞分裂就形成了单核的 子细胞，其细胞核中含有双亲细 胞的染色体。 五 细胞融合方法 1.生物法 病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于 病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个 细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某 些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（ HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因 HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用， 操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与 亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 原理与过程 （1）足够量的病毒颗粒附着在 细胞膜上起搭桥作用，使细胞 聚集在一起。 （2）通过病毒与原生质体或细 胞膜的作用使两个细胞膜间互 相渗透，胞质互相融合。粘结 部位质膜被破坏，不同细胞间 形成通道，细胞质流通并融合 （病毒也随之进入细胞质）。 （3）有丝分裂，细胞核融合， 形成杂种细胞。 2化学法 可以采用的化学诱导剂包 括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+ 离子、聚乙二醇（PEG） 、溶菌酶、明胶、抗体、 植物凝血素伴刀豆球蛋白 A等。 细胞膜电荷平衡被打破。 （ 1） NaNO3诱导融合 1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生 了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶 液中可以恢复并伴随着细胞融合。 1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融 合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界 第一株体细胞杂种。 NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷， 引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原 生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。 （ 2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合 1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers） 发现采用强碱性（例如pH10.5）的高浓度钙离子溶 液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下处理两个品系 的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可 以达到10%。 钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使 彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH