核酸的分离纯化技术.doc

PAGE PAGE 1 第一章 核酸的分离纯化技术 实验一 细菌DNA的分离提取 一、原理和用途 用EDTA络合二价离子，SDS结合膜蛋白，溶菌酶破坏膜结构，使DNA溢出到膜外，经氯仿异戊醇沉淀蛋白，可获得较纯的DNA。用于克隆细菌染色体上的目的基因、细菌污染检测，绘制基因图谱等。 二、实验材料 大肠杆菌或沙门氏菌等。 三、溶液与缓冲液 LB液体培养基： 精解蛋白胨 3.0 g 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3.0 g 葡萄糖 0.6 g 按上述配方用馏蒸水溶解至300 mL。用10 mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装150 mL三角烧瓶中，每瓶30 mL。然后置高压蒸汽消毒锅，以1.1 kg/cm2 灭菌20 min SE溶液： 0.15 mol/L NaCl 0.1 mol/L EDTA（pH 8.0）。 20% SDS 溶菌酶 5 mol/L过氯酸钠 氯仿/异戊(24:1)醇 20倍SSC溶液： 0.3 mol/L 柠檬酸钠 3 mol/L NaCl 10 mg/mL RNA酶： 称取10 mg核糖核酸酶A于灭菌的Ep管内，加1 mL 100 mmol/L pH 5.0的NaAc溶液，即为10 mg/mL RNA酶A，为了破坏脱氧核糖核酸酶，置80℃水浴中10 min或100℃水浴2 min，然后存-20 四、仪器设备及耗材 超净工作台；电热恒温培养箱；台式高速冷冻离心机；高速离心机；稳压电泳仪；紫外检测仪；水平式电泳槽；水浴锅；水平仪；摄影设备；高压蒸汽消毒锅；20 ?L、200 ?L、1000 ?L微量移液器。玻璃棒，500 mL三角烧瓶，100 mL、250 mL烧杯，50 mL、10 mL量筒，50 mL塑料离心管，1.5 mL Ep 五、实验方法 １．将200 mL LB液体培养基中生长的菌液4000 r/min离心10 min，收集菌体。 ２．用SE溶液洗涤菌体，重悬于20 mL SE溶液中。 ３．加入2.0 mL 20% SDS、10 mg溶菌酶，混匀，37℃保温，不时振荡，菌体溶解（约30~60 min）后，置60℃ ４．加入5 mol/L 过氯酸钠至终浓度为1 mol/L，再加入1倍体积的氯仿/异戊醇，缓振20 min，12000 r/min离心5 min。 5．转移水相到另一离心管中，加入2倍体积100%的乙醇，混匀，用玻棒轻轻缠出DNA细丝，加70% 冷乙醇300 ?L清洗。 6．将玻璃棒置离心管中，用0.1×SSC冲洗，使DNA溶解，然后用20×SSC溶液调整浓度为1×SSC。 7．加入2倍体积100% 冷乙醇，室温混匀-20℃ 8．4℃ 12000 r/min 9．加70% 冷乙醇300 ?L，清洗沉淀。4℃ 12000 r/min 10．加28 ?L TE，2 ? 11．制取0.7% 的琼脂糖凝胶板（含0.5 ?g/mL溴化乙锭），插好点样梳 12．凝胶冷却，加缓冲液使平板微淹没，抽出点样梳。 13．加1 ?L溴酚蓝，点样10 ?L，接通电源，电压50 V/cm，约1～2 注意： 1．方法5加入2倍体积100% 的乙醇后，可以接方法8，结果纯度稍差。 2．DNA谱带在点样孔0.5 cm 3．可以在方法1后，菌体重悬于10 mL SE溶液中，每人取1 mL菌液，以后按1/10量操作。 六．作业与思考题 1．用玻棒轻轻缠出的DNA细丝是什么样的？ 2．为什么加70% 冷乙醇300 ?L清洗？ 实验二 质粒DNA的分离提取 方法一 碱变性法提取质粒DNA 一、原理和用途 碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但是共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构象，保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成单链的网状结构。通过离心，染色体DNA与不定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱变性提取质粒的DNA可以用于酶切、连接、重组鉴定、PCR扩增和建基因文库等。 二、实验材料 大肠杆菌JM109(或DH5a)含有pUC18(或pGEM ) 三、溶液与缓冲液 LB液体培养基： 精解蛋白胨 3 酵母浸出粉 1.5 氯化钠 3 葡萄糖