微生物学通报融合表达氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE合成L-别异亮.pdf

微生物学通报 Sep. 20, 2018, 45(9): 2006−2013 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180424 研究报告 融合表达氨基转移酶DsaD 和异构酶 DsaE 合成 L-别异亮氨酸 1,2 1* 1,2* 纪晓奇 李青连 鞠建华 (1. 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 广东省海洋药物重点实验室 中国科学院海洋微生物研究中心 广东 广州 510301) (2. 中国科学院大学 北京 100049) 摘 要：【背景】L-异亮氨酸(L-isoleucine ，L-Ile)和 L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine ，L-allo-Ile) 是自然界中广泛存在的一对同分异构体。抗感染抗生素 Desotamides 结构中含 L-别异亮氨酸结 构单元，其生物合成途径中的氨基转移酶 DsaD 和异构酶 DsaE 可以协作催化 L-异亮氨酸和 L- 别异亮氨酸相互转化。【目的】通过理性设计，使氨基转移酶DsaD 和异构酶 DsaE 融合表达， 研究融合蛋白 DsaDE 催化异亮氨酸和别异亮氨酸相互转化的功能。【方法】利用PCR 分别扩增 dsaE 基因编码区 DNA 片段、以及含 dsaD 基因编码区和 114 个碱基接头序列的 DNA 片段 dsaD-linker ，利用酶切位点Kpn I 将 dsaE 和 dsaD-linker 相连，形成 dasDE 重组序列，并克隆 至pET28a(+) 中，将重组质粒pET28a-dsaDE 转化至Escherichia coli BL21(DE3) 中进行融合表达， 利用 Ni-NTA 亲和层析法纯化融合蛋白 DsaDE；分别以 L-异亮氨酸和 L-别异亮氨酸为底物进 行融合蛋白的体外酶活性检测，利用高效液相色谱对酶反应产物进行分析。【结果】PCR 验证、 酶切验证以及测序结果证明 pET28a-dsaDE 重组载体具有正确序列；N-末端和 C-末端融合 6 个 组氨酸标签的融合蛋白 DsaDE 在 E . coli BL21(DE3) 中获得可溶性表达，经 Ni-NTA 亲和层析法 一步纯化获得纯度约 95%的融合蛋白，纯化的融合蛋白 DsaDE 具有较好的活性，能够催化 L-isoleucine 和 L-allo-isoleucine 间的相互转化。【结论】氨基转移酶DsaD 和异构酶 DsaE 成功 融合表达，经一步 Ni-NTA 亲和层析法纯化即可获得纯度较高的融合蛋白，融合蛋白同时具有 氨基转移酶和异构酶的活性，为进一步研究 L-别异亮氨酸的工业化生产奠定了基础。 关键词：氨基转移酶，异构酶，融合蛋白，异亮氨酸 Foundation items: Natural Key Research and Development Program of China (2017YFD0201400); National Natural Science Foundation of China U1501223); Special Support Program for Training High-Level Talents in Gu