实时荧光定量CR技术原理和实际应用.pptxVIP

汇报人：朱林林 2011/03/25;目录;实时荧光定量PCR基本原理;常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板进行定量分析。 ;优缺点比较;定量PCR三个基本概念;定量PCR三个基本概念;定量PCR三个基本概念;C(t)与初始模板含量;荧光定量PCR的定量原理;荧光定量PCR的化学原理;SYBR Green I法;SYBR Green I法溶解曲线分析;荧光染料的特点及应用;TaqMan探针法;TaqMan作用机理;两种化学的比较;实时荧光定量PCR的实验设计;绝对定量与相对定量;定量PCR--绝对定量;定量PCR--相对定量;实时荧光定量PCR两种相对定 量方法比较;相对标准曲线法;适用范围;2-ΔΔc(t) 法;一般步骤;适用范围;实时荧光定量PCR误差分析 及操作规范;1、误差分析;（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差 （4）、操作引起的误差 样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。 ;2、操作规范;（1）、样品的处理及选取 处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。 ;（2）、核酸提取 加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNA OD260/280＝2.0左右，DNA OD260/280＝1.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。 （3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。 ;（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。 （5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。 （6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。 ;（7）、重复操作 让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是在提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。 同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。;同一cDNA样品的三个重复;模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们 在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提 前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。;实验中污染的防控;1、荧光定量PCR实验中污染源的分析;（2）、标准品引起的污染 常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的PCR产物等，由于标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有可能引起污染。 ;（3）、高浓度的样品引起的污染 高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。 ;2、荧光定量PCR实验中污染的防控;（2）、对于标准品引起的污染 目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操作台隔离开。 ;（3）、对于样品间的检查污染 样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶胶，因为样品的cDNA链较长，经常开紫外灯，把长链cDNA打断，能有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止此类污染。 ;（4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控 这类污染也经常出现，找不