凝胶层析(生化实验).pptVIP

（1）Sephadex凝胶（Pharmacia，100ml小烧杯中，装柱用） 实验步骤 调速：注入一段磷酸缓冲液，掐表，调节流速1滴/5sec 装柱：待 柱中磷酸缓冲液将流尽时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶搅拌均匀后，一次性快速倒入柱中(注意请不要用玻棒导流)，自然沉降20min后，用镊子小心在 胶面上放置圆片滤纸(直接加在缓冲液中，滤纸会自动沉降到胶面)。 平衡：打开恒流泵，平衡10min，注意随时添 加缓冲液，防止柱床干裂 轻轻振荡血红蛋白管，用移液器量取50μl 血红蛋白与150μl DNP-鱼精蛋白充分混匀。 上样：待缓冲液进入柱床的瞬间，关掉恒流泵，用移液器小心加入混合好的样品，打开恒流泵，待样品进入柱床瞬间关掉恒流泵，用移液器小心加入磷酸缓冲液至柱顶。 旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，观察并记录现象。 待所有有色带完全流出后，加快流速，继续清洗凝胶柱5min 停止蠕动泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片，物归原位待老师检查后离开。 样品进入柱床瞬间 注意事项 1.装柱前请务必检查柱子的上下是否 装反; 2.装柱及后面的实验过程中要尽量避 免层析柱的震动与倾斜; 3.实验中始终不能使柱床干裂; 4.上样时要小心，避免破坏柱床面; 5.拆卸柱子时请勿将胶圈丢失; 6.实验后请勿用自来水冲洗层析柱。 避免使柱床干床 干裂 的柱床 （1）在向凝胶柱加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？样品之间比例对分离效果有何影响？ ??（2）为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？ （3）某样品中含有1 mg A蛋白（MW 10,000Da），1 mg B蛋白（MW 30,000Da），4 mg C蛋白（MW 60,000Da），1 mg D蛋白（MW 90,000Da），1 mg E蛋白（MW 120,000Da），采用Sephadex G-75（排阻上下限为3,000-70,000Da）凝胶柱层析，请指出各蛋白的洗脱顺序。 问题与思考 * This flow chart is more simplified than the other one. What do you think? For “separation graphic” show image of the chromatographic apparatus instead of a box. Combine fractions box: Graphic of little tubes pouring into a bigger beaker. We need to fit in a short text block with a description of the steps in order using numbers to label the steps. 生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质 生物化学实验 上海交通大学生命科学技术学院 实验目的 了解生物大分子分离、纯化的方法 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝胶柱层析的基本操作技术 进一步了解和掌握其他层析技术 Purification is a multi-step procedure. Sample Separation technique Fractionation Is there activity? Set aside No Combine Fractions yes Monitor purity Assay total protein Assay enzyme activity Pure? Prepare for analytical technique yes No Repeat with another separation technique until pure Chromatography General strategy of protein purification Characteristic Procedure Charge: 1. Ion exchange chromatography 2. Electrophoresis 3. Isoelectric focusing Polarity: 1. Adsorption chromatography 2. Paper chromatography 3. Reverse-phase chromatography 4. Hydrophobic interaction chromatography Size: 1. Dialysis