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ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用 摘 要： 禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。ELISA 方法以其特异、 灵敏、 快速、 简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为 AI 流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。 关键词： 禽流感 ELISA 诊断 禽流感（Avian Influenza，AI）是由 A 型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878 年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为 A 类传染病。 禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化， 因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。 因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。 禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、 快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长， 不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。 ELISA 检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。 1 间接 ELISA 1.1 基于全病毒的间接 ELISA 黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2 亚型 AIV）经处理后作为 ELISA 检测方法的包被抗原。并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接 ELISA 方法。该试验建立的 ELISA 方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的 P/N 值，还可用回归方程算出 ELISA 效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平， 制定合理的免疫程序提供了科学的依据。 1.2 基于核蛋白（NP）的间接 ELISA 禽流感核蛋白具有有型特异性，同型流感病毒核蛋白氨基酸具有很高的同源性，因而纯化重组蛋白可以用来代替全病毒作为 ELISA 的诊断抗原。用重组核蛋白作为抗原克服了常规全病毒抗原的许多不利之处， 整个生产过程中不涉及禽流感病毒，因此生物安全性好，不存在散毒的危险，而且生产成本低，易于规模化生产。 李海燕等[2，3]用表达禽流感病毒（AIV）核蛋白基因的杆状病毒感染 Sf9 昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（rNP_ELISA）。 根据对 140 份 SPF 鸡血清检测结果的统计分析，确定其判定标准为 OD 值大于0.15 的血清样品为阳性。 用 rNP_ELISA 检测 150 份SPF 鸡血清、194 份非免疫鸡血清及 30 份其它 15种鸡疫病阳性血清均为阴性； 检测 A 型 AIV 的 15个不同亚型 （H1-H15） 毒株的特异性血清均为阳性；对人工接种 AIV 的 SPF 鸡第 3d 即能检出抗体，到第 162d 试验结束时检测仍为阳性。 对 3 138 份鸡血清进行监测，rNP_ELISA 与全病毒间接 ELISA（AIV_ELISA）、琼脂扩散试验（AGP）及血凝抑制试验（HI）的符合率分别为 99.9%、97.1%、98.8%；并能 100%检出 AGP 阳性及疑似、HI 阳性的血清样品。 试验证明，rNP_ELISA 是检测 A 型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。 其并将成熟的禽流感间接ELISA 快速诊断技术试剂盒化，该试剂盒与进口禽流感间接 ELISA 诊断试剂盒对同样血清样品检测，符合率为 100%。 吴仁蔚等[4]以 AIV 的 H9N2 亚型全长 NP 蛋白为包被抗原，建立了检测 AIV 抗体的间接 NP-ELISA方法。 对 263 份待检血清（包括临床收集的 243 份血清和 20 份 H9N2 亚型 AIV 免疫鸡阳性血清）进行检测，NP-ELISA 与琼脂免疫扩散试验 （AGP）的总符合率为 83.3%，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为 92%。 异性试验表明，NP-ELISA 方法可以检测 H5、H7 和 H9 亚型 AIV 特异性抗体， 检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实 NP-ELISA 最早可以检测鸡感染后 7d 的血清样品，并于感染后 10d 确定 100%血清阳性，而AGP 检测直到首免后 21~28d 才出现部分血清阳性，HI 检测直到 10~14d 才出现部分血清阳性，并且 NP-ELISA 要比 HI 敏感 4~40 倍。将禽流感病毒核蛋白（NP）