DNA的构建和目标基因的筛选.docVIP

PAGE PAGE 243 第十一章 DNA文库的构建和目标基因的筛选 文库的英文名称是Library，指图书管理系统。基因文库（也称DNA“文库”）是指某一生物体全部或部分基因的集合，象一个没有目录的“基因图书馆”。某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库（gene library）由外源DNA片段、载体和宿主等三个部分组成。 高等生物的基因组十分复杂，单个基因在基因组中或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。哺乳动物单倍体基因组大约含有3?109个碱基对（base pairs, bp），一个3 000 bp 的DNA片段只占基因组总DNA的百万分之一。同样，一种稀有mRNA可能只占总mRNA的十万或百万分之一。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知序列基因并进行遗传操作是很难的，必须构建基因文库对该基因进行体外扩增，利用一些文库筛选技术获得包含该基因的阳性克隆，然后对阳性克隆进行分析。 基因文库构建的基本程序包括：①提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；②DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；③重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；④阳性重组菌落或噬菌斑的选择。构建基因文库目的是为了从中筛选出所感兴趣的目的基因，常用的筛选方法有核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法等多种方法，必须根据所研究基因的各种信息如表达丰度、蛋白质特性和DNA序列等以及基因文库的特点和类型选择适当的筛选方法。 按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为基因组DNA文库（genomic DNA library）和cDNA文库（complementary DNA library）。基因组DNA文库是指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段、与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。其实质就是采用不同的“化整为零”策略，将巨大的基因组分解成一段段来研究，而每段包含一个或几个基因。通常所说的基因组DNA文库主要针对染色体基因组而言，但基因组DNA文库通常含有一定比例的重组体，其外源DNA来自染色体以外的DNA，如线粒体和叶绿体等细胞器DNA以及质粒DNA。也可分别提取这些染色体外的DNA构建亚基因组文库。 cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementary DNA, cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的。也就是说，cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体。由于基因表达具有组织特异性和发育时期特异性，因此cDNA文库所代表的基因也就具有这样的时空特性，它仅包含所选材料在特定时期里表达的基因，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。 基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具有时空特异性。cDNA文库反映了特定组织(或器官)在某种特定环境条件下基因的表达谱，因此对研究基因的表达、调控及基因间互作是非常有用的。但是，由于mRNA是基因转录加工后的产物，不包含间隔序列及调控区。而基因组文库包含了基因的全部信息，如编码区及非编码区、内含子和外显子、启动子及其所包含的调控序列等，为全方位研究基因的表达、调控等提供了信息。 由于基因组DNA文库和cDNA文库性质上的不同，在实际应用中应根据研究的目的选择构建和利用何种文库。如果研究的目标不是表达的基因，而是控制基因表达的调控序列或在mRNA分子中不存在的另外一些特定序列（如内含子），则只能选用基因组DNA文库来研究。而对于原核生物来说，由于没有内含子和mRNA的多聚A尾，因此没有必要同时也不便于构建cDNA文库，主要通过构建基因组文库来克隆目标基因。总的说来，两种文库都在基因的分离与克隆领域应用广泛，其中在结构基因组研究中，全基因组物理图谱构建和测序等工作都离不开基因组DNA文库，而cDNA文库在注释基因和研究基因的功能方面应用更多。构建基因文库的目的是用来分离克隆目的基因、构建覆盖生物体基因组的物理图谱、基因组测序以及研究基因的表达谱。 第一节 基因组DNA文库的构建 一、基因组DNA文库的类型和发展 用于构建基因文库的载体主要有质粒、噬菌体、粘粒及人工染色体等，有关这些载体的知识参见本书第五章和第六章。构建大片段基因组DNA文库使用的载体主要有λ噬菌体载体、粘粒载体(cosmid)、细菌人工染色体载体(BAC)、酵母人工染色体载体(YAC)、P1噬菌体载体和P1人