生物分离工程第四章沉淀分离法.pptVIP

第四章 离心和沉淀分离法 ; 大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。 浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。 粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。 对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。 而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有一些发酵液则不行。 ;问 题;离心法与过滤法的比较; 离心分离原理 ; 离心技术分类;二、沉淀分离法 ;2、类型;沉淀法操作步骤 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进晶体生长； 离心或过滤，收集沉淀物；;沉淀法的优点： 设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高； 沉淀法的缺点： 所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。;沉淀法分离蛋白质的特点有： 1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用； 2 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降到最低。;（二）盐析沉淀法 ;2.盐析原理;蛋白质溶液的稳定性;盐析示意图;3.盐析过程;离子强度对盐析过程的影响;β和Ks的物理意义;经验方程的图示;在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析法。 （Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度） 2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度） 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般粗提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常用第2种方法。;4、盐析剂的选择;阴阳离子盐析效果;5、影响盐析的因素;6、盐析沉淀法的特点 ;（三）有机溶剂沉淀法 ;有机溶剂中的蛋白质沉淀;3、有机溶剂的选择;常用的有机溶剂沉析剂;4.有机溶剂沉淀的特点;温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；一般在0℃以下，操作时在冰盐浴中进行。 搅拌速度：散热 溶液pH值：通常选在等电点附近 离子强度:离子强度低有利于沉析，盐浓度一般在0.01~0.05mol/L 生物样品浓度: 蛋白质溶液的起始浓度0.5~2%，粘多糖起始浓度1~2%为宜。 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+;（四）等电点沉淀法;4、特点;（五）高分子聚合物沉淀法;PEG沉淀法机理： PEG分子亲水性强，优先水合，使得蛋白质等从溶剂中析出. 优点 1 体系的温度只需控制在室温条件下； 2 沉淀的颗粒往往比较大，同其???方法相比，产物比较容易收集； 3 PEG非但不会使蛋白质变性而且可以提高它的稳定性， 缺点 PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液－液萃取来解决。 广泛应用于核酸、酶的分离;3、特点;（六）金属离子沉淀法;3、特点;（七）选择性变性沉淀法;选择性变性的方法;思考题