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实验题 蛋白质—实验题 下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：异硫氰酸苯酯、丹黄酰氯、2,4一二硝基氟苯(DNFB)、脲、 HCl、β-巯基乙醇、水合茚三酮、过甲酸、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。其中哪一个最适合完成以下各项任务？ （1）测定小肽的氨基酸序列。（2）鉴定肽的氨基末端残基。（3）不含二硫键的蛋白质的可逆变性；如有二硫键存在时还需加什么试剂？（4）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。（5）在赖氨酸和精氨酸残基羧基侧水解肽键。 （1）异硫氢酸苯酯； （2）丹黄酰氯；2,4一二硝基氟苯 (DNFB) （3）脲、β-巯基乙醇； （4）胰凝乳蛋白酶； （5）胰蛋白酶。 一、蛋白质的抽提原理及方法 1、概念： 蛋白质的抽提：指蛋白质与细胞固体成分或其它结合成分的分离，是由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程。 2、蛋白质的抽提方法 1）水溶液提取 2）有机溶剂提取 1、水溶液提取 球状蛋白质的提取一般以水溶液为主，以盐溶液及缓冲液提取蛋白质和酶时常需注意以下几个因素： 盐浓度：常用等渗溶液，如0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 0.15mol/L氯化钠溶液 pH值：保证蛋白质在稳定的范围内，选择在偏离等电点的两侧，常为pH3-6。 温度：0-5°C 其它：加入保护剂、底物、辅酶等 2、有机溶剂提取 一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，常用有机溶剂提取，如丁醇提取法（pH3-10，-2 ~40°C） 二、蛋白质的分离纯化 1、概念： 蛋白质的分离纯化：在抽提的基础上，去除多种同类或异类物质的过程。 2、蛋白质的分离纯化方法 1）盐析法 2）有机溶剂沉淀法 3）等点沉淀法 4）选择性变性法 5）吸附法 6）离心沉淀法 7）透析法 8）超滤法 9）酶解法 10）电泳法 11）层析法 一）利用溶解性质的不同进行蛋白质的分离纯化 1）盐析法 原理：盐溶：由于少量离子的作用，减少了偶极溶质分子之间极性基团的静电引力，增加了溶质和溶剂相互作用力的结果。 盐析：由于盐浓度增加到一定程度，水的活度被降低，蛋白质表面的大量电荷被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。 盐的选择： 硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 2）有机溶剂沉淀法 原理：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另一方面，由于溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质沉淀析出。 有机溶剂沉淀法的优缺点： 优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内才会沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易；在生化制备中的应用比盐析法广。 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行，加入有机溶剂时注意搅拌以避免局部浓度过大。分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。 3）等点沉淀法  利用蛋白质在等电点溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用。 4）选择性变性法 选择一定的条件使其它蛋白质沉淀而又不影响所需蛋白质的分离方法。如将提取液适当加热、用惰性液体氯仿震荡、利用酸碱或加入重金属离子等进行选择变性。 二）利用分子大小的不同进行蛋白质的分离与纯化 1）透析法 透析：透过薄膜除去或添加小分子溶质的过程。可用于生物大分子脱盐、浓缩及添加小分子溶质。 透析袋：透析袋的膜孔有大有小，要根据欲分离的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、蛋白质胶膜等。目前常用的透析膜是由纤维素类物质制成的。 透析的操作： 2）超滤法 超滤：加压膜分离技术之一，以超滤膜为分离介质，通过对薄膜上的溶液加压过滤，使小分子物质通过，大分子物质则被截留。这种利用超滤膜分离大分子和小分子物质溶液的方法称为超滤。这一近年来发展起来的新方法最实用于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩和脱盐，并具有成本低、操作方便、条件温和、回收率高、能较好地保持生物大分子的生理活性等优点。超滤法还可用于生物大分子的分离纯化，是目前发展较快且为人们乐于采用的生化技术之一。 超滤膜的特点：微孔过滤用的膜平均直径为50nm-14um，用于分离较大颗粒。加压超滤用的膜平均直径为1-10nm，用于分离大分子溶质。反渗透作用用的膜平均孔径最小，一般在1nm以下，用于分离小分子溶质。超滤膜可截留不同分子量的溶质，常用的规格有10