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活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌蛋白表达原理
诱导原理 :Lac 阻遏物是一种具有 4 个相同亚基的四级结构蛋白 ,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在
时 ,lac操纵子 (元 )处于阻遏状态 ,Lac 阻遏物能与操纵基因O结合 ,阻碍 RNA 聚合酶与 P序列结合 ,抑制转
录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后 ,其蛋白构象就发生变化 ,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来 ,RNA
聚合酶不再受阻碍 ,发生转录。详情见 IPTG诱导蛋白表达的原理
大肠杆菌表达系统步骤
不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化 ,蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主
要包括蛋白表达鉴定 :
1. 表达鉴定第一天的任务 ,常用抗性选择根据感受态细胞选择
拿到质粒 ,离心 (3000r/min ;2min )
在质粒中加入 TE (使质粒最终加入到 110μL感受态细胞中的量为 80-100ng ,据此确定加入 TE的量
一般为 (1μg质粒加 20μLTE ;2μg质粒加 50μLTE ;5μg质粒加 100μLTE )
将质粒与 TE混匀 ,加入 2μL混液于感受态细胞中
将感受态细胞放入冰箱 (4℃ )中 ,30min
取出后立即放入水浴锅中 (42℃ ),热激 90s ,
再次放入冰箱 (4℃ )中 ,3min
拿出后取 200μL的 LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
放入摇床 (37℃ ; 195r )中 , 30nim至 60min ; (最佳 45min )
取出离心 (3000r/min ;2min )
去掉 200μL的上清 ,留 100μL左右上清悬浮沉淀 ,吸取 50μL悬液涂平板 ,(先将对应抗性的平板放入培
养箱 (37℃ )中预热 20min )
把平板放入培养箱 (37℃ ),过夜 (12h至 16h )
2. 表达鉴定第二天的任务 ,注意 Pcold 的表达温度
每个平板挑取单菌落至 4 支对应抗性的 LB (4ml )试管中 ,编号为 “0” “1” “2” “3”
Tel: 025 5889-4959 www DetaiBio com Order@DetaiBio com
( ) 。 。 。
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
将试管放入摇床 (37℃ ;195r )中 ,(单抗 3h左右 ;双抗 4 左右 ;刚开始用可见分光光度计测 OD值 ;
熟练后可目测 (背光下 ,以试管中的枪头为例 ,刚刚看不见枪头即可 )),测 OD值 (0.6至 0.8 )
从 “0”号管中取 700μL悬液加入到 100μL (C=80% )的保种甘油中 ,震匀 ,放入冰箱 (-20℃ )冻存
在每组菌的 “1” “2” “3”号试管中分别加入 2μL的 IPTG (终浓度 0.5mM最适 )
视不同的载体选择适合的表达环境 (PET/PGEX :15℃表达过夜 ;25℃表达 6h ;37℃表达 3h至 4h (4 支
试管 , “0” “1”号试管 15℃表达过夜 ;“2” “3”试管 37℃表达 3h至 4h )。Pcold :全部 15℃表达
过夜 )
3. 表达鉴定第三天 ,全菌的表达鉴定分析 ,注意控制溶质的量及溶液黏度
从每组 4 支的试管中均取 500μL菌液加入到 1.5ml离心管中 ,(若 OD值不一样 ,值小的可多取 )离心
(6000r/min ),5
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