课件：中药中黄曲霉毒素的检测.pptVIP

2010年版一部第二增补本修订了附录方法 ?删除了流速规定 ??增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法 ?取消了免疫亲和柱的品牌规定 2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法 ?增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法 ?增加附注：“当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认” 2015年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导原则 ?基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、限值拟定） ?基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法） THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 2015年版四部通则9302 中药有害残留物限量制定指导原则中关于黄曲霉毒素的规定 “由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。 《中国药典》2015年版正文收载品种 根及根茎类：远志 果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁 动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣 共19种，较2010年版药典增加14种 黄曲霉毒素药典检测方法详解 液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42） 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生 混合对照品溶液的制备：液体标液 （B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3 ug/ml）梯度稀释500倍 供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化 测定： 吸取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液20-25μl，测定 方法来源：《中国药典》2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法 基本步骤 ?提取 ?净化（活化、上样、洗杂、洗脱） ?测定 ?随行质量控制（质控样、随行加样回收） 泵流操作架 免疫亲和柱 HPLC-荧光检测器 光化学衍生器 自动固相萃取仪 净化步骤 取15ml（离心后的提取液），加水至50ml 滤过，取20ml，通过免疫亲和柱，流速3ml/min 加水洗涤两次，每次10ml 过空气10秒，将水挤出柱子 分次加甲醇1.5ml，自然洗脱，过空气，定容至2ml 免疫亲和柱的原理 利用抗原－抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化目的 黄曲霉毒素 单克隆抗体 杂质 黄曲霉毒素的衍生化 衍生原因 黄曲霉毒素B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法 ?碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗 ?光化学衍生法：紫外光灯（254nm ）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无需冲洗 对黄曲霉毒素B1和G1进行衍生，黄曲霉毒素B2和G2不受该衍生步骤的影响 AFB1 AFG1 黄曲霉毒素的衍生化 黄曲霉毒素的衍生化 结果报告 未检出 限度内 限度外 方法难点 痕量分析——ppb级，要求高灵敏度 毒性强，具有一定的风险性——安全防护措施 基质复杂 注意事项 取样的代表性 黄曲霉毒素在样品中分布不均匀 免疫亲和柱的使用 储存、使用温度（使用说明书） 安全防护 操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套 注意事项及实验室建议 对照品的使用 使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置 对照品贮备液避光、低温、密闭保存，工作液现配现用 试验废弃物处理 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含10%次氯酸钠溶液内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净） 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理 实验室的建议 专门的仪器设备和场所 安全措施 废弃物 谢谢！ THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 中药中黄曲霉毒素的测定 目录 真菌毒素简介 黄曲霉毒素概述 黄曲霉毒素现有检测方法介绍 黄曲霉毒素检测药典收载情况 药典检测方法详解 注意事项及实验室建议 真菌毒素简介 真菌毒素：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。 Mycotoxin：源于希腊语（Mykes）和拉丁语（Toxicum） 常见真菌毒素分类 真菌种类 所产毒素 曲霉属 黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A 镰刀菌属 玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素、伏马毒素 青霉属 展青霉素、桔青霉素 真菌毒素监控意义 真菌毒素对食品安全的危害 真菌