Bax表达产物的检测.ppt

细胞与遗传实验 上一周的实验结果 细胞活力检测结果 细胞形态学观察结果 Gimsa染色---细胞形态 Hochest染色---细胞核形态 下一步的实验？ Control GD DDP20 DDP40 DDP60 凋亡相关基因－Bax的表达产物的检测 免 疫 细 胞 化 学 原 理 免疫细胞化学是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原作定性、定位以及定量检测。  antigen Bcl-2 家族成员 Bax Once activated, the normally cytoplasmic Bax assumes a conformation that exposes its C-terminal membrane insertion domain allowing it to integrate into the outer mitochondrial membrane. Bax6A7抗体： 构象特异性的抗体，识别Bax的膜插入片段，仅在Bax构象发生改变、活化后才能与之结合 SABC (StreptAvidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物) DAB：3,3′-二氨基联苯胺 DAB显色 In the presence of H202 (hydrogen peroxide) DAB is converted to an insoluble brown reaction product by the enzyme HRP (horse radish peroxidase) the reaction is something like this:DAB + H202 DAB reaction product+ H20 HRP 器材与试剂 仪器：移液枪、枪头、显微镜、湿盒、96孔板 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3％H2O2-PBS、 试 剂 说 明 PBS： 磷酸盐缓冲液（0.01M,PH7.4） 封闭液： 5%BSA 一 抗： Bax6A7，用时PBS稀释（1：300） 二抗： 生物素山羊抗小鼠IgG SABC (StreptAvidin-biotin-peroxidase complex ) DAB(diaminobenzidine)显色液（现配） ： 3,3′-二氨基联苯胺 实验步骤 (Day 1 and 2) 接种5×104/ml细胞于96孔板，每孔200ul培养液；分为五组，每组三个平行孔；37oC、5%CO2培养24h（对数生长期） ----此时属正常培养，高糖培养基（10%DMEM） 1、24h后，Control 组继续用高糖培养基培养 2、24h后，无糖损伤组弃去培养液，随后加入无糖培养基培养（弃去或加入培养基时均应小心）继续培养24h ------ GD组 3、24h后，DDP（顺铂）组弃去培养液，分别加入浓度为20umol/l，40umol/l， 60umol/l的培养基，继续培养24h 实验步骤 (Day 3) 4.PBS洗，2次 ，3min/次 5.甲醇固定6min 6.PBS洗，3次，3min/次 7.加入封闭液, 25μl，37 ℃，30min 8.吸弃上清液；加一抗（1:300）25μl，37 ℃，1~2h，4 ℃过夜 实验步骤 (Day 4) 9.PBS洗3次，3min/次 10.加二抗25μl，37 ℃，1h以上 实验步骤 (Day 4) 11.PBS洗，3次，3min/次 12.加0.3％ H2O2-PBS，37 ℃，30min 13.PBS洗，3次，3min/次 14.SABC工作液 25μl，37 ℃，30min 15.PBS洗，3次，3min/次 16.DAB显色，镜下控制，蒸馏水终止反应 观察结果 结果观察 1.细胞的染色情况，包括整体细胞的染色密度以及深染细胞数 2.细胞的密度 3.细胞的形态学观察 4.…… 缺糖前 hela 细胞 缺糖 24h hela细胞 缺糖 48h hela 细胞 缺糖前 PC 12细胞 缺糖 24 h PC 12细胞 缺糖 48 h PC 12细胞 注意事项 一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背