荧光及荧光标记.ppt

* Fluorescence Spectra Viewer * 2 注意标记的方法 /handbook/ 不同的荧光探针要求不同的标记方法 标记温度，pH，浓度，时间 * 注意区分是否可以自由跨膜 可以自由跨膜的染料 AO， FDA， DAPI * 可以自由跨膜 酯化的染料 (-AM) (多数离子指示探针) fura-2 AM cell permeant * 不能跨膜的染料要注意标记的方法：杀死细胞，破坏细胞壁，显微注射，高渗冲击， Ballistic microprojectile delivery ATP-induced permeabilization 等 * A 固定细胞的荧光标记 1 固定 PBS缓冲液，2－4％多聚甲醛固定液in PEM buffer (0.1 M PIPES, pH 6.5; 1 mM MgCl2; 1 mM EGTA) （戊二醛固定增加自发荧光） 2 冲洗 PBS缓冲液 3 透化 0.1－1% Triton X-100 4 加入荧光探针标记，冲洗（冲洗彻底，避免非特异的吸附），观察 * B 免疫荧光标记 1 固定杀死细胞（固定液要能保护抗原， 常用2－4％多聚甲醛固定液） 2 冲洗 3 透化 或者 切片 4 一抗标记 5 荧光二抗标记（荧光二抗在许多公司都能买到，FITC或者TRITC标记） * 3 观察过程中的注意事项 3.1 减缓荧光淬灭－－ 在黑暗的地方操作 避免溶液中含有碘/铁或者氧化剂。 或者加入光漂白的保护（只适用于固定的样品）： N-propyl gallate 或者p-phenylenediamene (PPD) * 荧光的衰减 防衰减的方法 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低激发光强度 降低标本中氧的浓度 有衰减的标本 * 使用抗衰减剂 * 广泛应用的抗衰减剂 * 3.2 选择合适的激发光和激发光的强度（在能够观察到所需结构的情况下，激发光强度尽量要低） 3.3 注意选择合适的滤光片 * 常用的荧光探针 (1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 Ex/Em：505/534 ，可染活细胞， 最佳探针: Mitotracker Green FM Ex/Em： 490/516, 染活细胞或固定细胞，稳定不漏出: 包括 Red ， Orange * (2)液泡： Neutral red NR Ex/Em：541/640: 微偏碱性, 可标记酸性器官为非特异性。 AO－acridine orange Ex/Em：502/526微偏碱性, 可标记酸性器官为非特异性。 LysoTracker Green Ex/Em：504/511, 染活细胞? LysoTracker Red Ex/Em：577/592 FM 1-43 Ex/Em：510/626 染活细胞? FM 4-64 Ex/Em：506/750 染活细胞? * (3)内质网 DiOC6 Ex/Em：484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体 ER-Tracker Green Ex/Em：504/511 染活细胞? ER-Tracker Red Ex/Em：587/615 染活细胞? * (4)高尔基体 NBD C6-ceramie Ex/Em：466/536, 可染活或死细胞 BODIPY TR-ceramide Ex/Em：589/617 * (5)细胞核 碘化丙啶(PI, propidium iodide) Ex/Em：536/617死细胞DNA/\RNA DAPI Ex/Em：350/470 可染活或死细胞(紫外激发) EB (ethidium bromide) Ex/Em：518/617 DNA/RNA 死细胞 AO (Acridine Orange) Ex/Em：500/526 DNA 活细胞? Ex/Em：460/650 RNA * (6) 荧光蛋白 主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 BFP Ex/Em：380/440 nm eCFP Ex/Em：434/477 nm wtGFP Ex/Em：395/509 nm eGFP Ex/Em：489/509 nm eYFP Ex/Em： 514/527 nm dsRED Ex/Em： 558/583 nm * (7) 游离Ca2+测量 这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合