细胞破碎及包涵体处理.ppt

* 包含体的形成并非都是坏事， 包含体蛋白质避免遭受宿主蛋白质的降解作用， 对宿主细胞不会造成毒害，影响生长，这可能是大肠杆菌获得高表达的原因之一。 二. 包涵体处理过程 细胞破碎 目标蛋白的变性溶解 包涵体的洗涤 目标蛋白的复性 细胞收集 包涵体获得 离心处理 膜分离 碎片分离 洗涤的重要性：收集的沉淀中，杂质较多，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、去污剂Triton X-100、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸盐等。充分洗涤以去除杂质，避免重组蛋白的降解。 包涵体的洗涤 强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。 SDS等去垢剂，破坏蛋白内的疏水键。 对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、半胱氨酸。 目标蛋白的变性溶解 * 影响变性因素： 时间 pH 离子强度 变性剂种类和浓度 方法：磁力搅拌至全部溶解 透析 稀释 超滤 凝胶过滤层析 目标蛋白的复性 当变性剂除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 要求：复性过程缓慢 复性的目标 * 控制蛋白质浓度1-20ug/ml，低蛋白浓度，高复性收率 具有--s—s—的蛋白，空气中氧使之氧化，钙离子，巯基乙醇，谷胱甘肽有助于复性 pH 8-10，时间12-24hr 加入单克隆抗体有效 影响复性因素： * 复性区 多聚物生成区 絮凝沉淀区 盐酸胍浓度mol/L 红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质浓度 mol/L 当变性剂移走后，蛋白质分子可能重新聚合，生产二聚体、三聚体或多聚体、甚至形成变性沉淀物 控制蛋白质浓度1-20ug/ml，低蛋白浓度，高复性收率 蛋白质复性影响因素： 变性剂浓度 目标蛋白浓度； * 蛋白质复性复杂，复性率非常低，一般不超过20％。原因是当变性剂移走后，蛋白质分子可能重新聚合，生产二聚体、三聚体或多聚体、甚至形成变性沉淀物。 克隆表达的结构复杂的基因工程药物，其复性过程更为复杂，受很多因素影响。 包含体复性的回收率 三 实例：人 ?-干扰素的后处理工艺 发酵液 离心(发酵液冷却至10?C以下，4000r/min离心10min) 菌体 细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包含体 提取变性(包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min) 变性液 稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT)，使尿素浓度小于0.1M，4?C下搅拌24h） 复性液 浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min) 浓缩上清液 Sephacryl s-200柱层析分离 层析柱2?100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱 收集主峰、冻干、终产物 (纯度可达100%，DNA及热源合格) * 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白（TNF-related apoptosis inducting ligand）在E.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达： ◆ 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%） ◆ 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%）。 悬浮破壁 PBS 洗涤 离心 硫铵沉淀 亲和层析 阳离子交换层析 溶解 复性 亲和层析 湿菌体 发酵液 干净菌体 上清液 包涵体 纯品 活性检测 破壁液 离心 离心液 洗涤 举例：TRAIL的分离纯化 * 1. 包涵体的洗涤 ① 粗制包涵体用 50mM磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) 洗涤2-3次； ② 用含有1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤1次 (1:3 w/v)，将粘附其表面的大部 分蛋白及水溶性杂质除去； ③ 用6M尿素及0.5%T