结核CR培训.ppt

一、结核分枝杆菌基础知识 二、分子诊断PCR技术基础知识 三、生产操作程序 结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染病。结核菌能侵入全身各个器官，但80%发生在肺部，常称肺结核。 常见肺外结核： 淋巴结核（最常见）、结核性脑膜炎（最严重）、 结核性胸膜炎、肠结核、肾结核、 附睾结核、 女性生殖系统结核（引起不孕不育）、骨关节 结核等。 结核病 中国结核病流行现状 5 肺结核 确诊病例 临床诊断病例 疑似病例 仅培阳肺结核 肺部病变标本病理学诊断为结核病变者 标本查到结核分枝杆菌 5 岁以下儿童TB密切接触史 或PPD强阳性伴有肺结核病临床症状者 3 份痰标本涂片阴性,或结核中毒症状 胸部影像学检查怀疑有活动性TB可能性 影像符合活动性TB,PPD强阳性具有可疑症状 血清免疫学检查阳性; 疑似TB经诊断性治疗和/ 或排除类似疾病 结核病诊断标准（WS288-2008） 在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链5‘-3’合成反应。 通过特殊的仪器不断满足上述条件，则DNA单链的5‘-3’合成反应可不断进行下去，直到条件不复存在。实际上是模拟天然DNA复制过程。 PCR技术原理 PCR技术原理 基本过程 1.变性：双链DNA解链成为单链DNA􀂾 2.退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配 对和结合 3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 可能造成的污染 1.纯化限制性酶切的目标片段 2.包含目标序列的质粒DNA 3.处理PCR产物过程造成的反应后污染 PCR技术原理 防止污染的操作 1.实验室要求：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区；提取或加样用的超净台或安全柜有排风管直通室外。 2.操作要求：使用滤芯吸头；10ul吸头使用细长吸头、在准备新反应前更换手套；试验用器材高压消毒或10％次氯酸钠消毒、清洁实验台面、254nm波长紫外线照射；减少开盖次数。不用移液器吹吸混匀试剂，以防止产生气溶胶污染移液器。 3.设置对照：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。 4.UNG防污染：在 PCR 反应液配制时，将dUTP和dTTP 按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对 UNG 敏感，在 PCR 前对新配制的反应用 UNG 处理以破坏残余产物，杜绝污染。 PCR技术原理 普通PCR技术的优点及缺点 优点：高灵敏度 高特异性 简便、快速 缺点：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对 起始模板准确定量。 无法对扩增反应实时检测。 开盖检测“气溶胶”污染问题。 PCR技术原理 配制标准 环境：十万级洁净生产区。 提前准备好配置所需的容器、化学试剂、原料等 按照表中成分称取需要的化学试剂，并核对后置于适当的配制容器中。 加入部分纯化水搅拌直至完全溶解，记录溶解开始时间；溶解结束时间；溶解持续时间。 如需调节PH值，必要时可用HCl或NaOH调pH值至规定的范围内。 加纯化水定容到终体积，充分搅拌均匀，搅拌时间不少于20分钟并记录。 根据不同液体所需要的不同规格滤膜进行过滤，除去杂质。 贴标签（注明名称、批号、批量、贮存温度、配制日期和配制人及保存期限）后于适当的条件保存。 自检：确认核对制备程序符合工艺要求；确认核对配液记录填写真实、正确。 按相关SOP执行清场，填写清场记录。 生产操作程序 分装操作程序 环境：十万级洁净生产区 根据生产指令领取试剂瓶、盖和规定批号的耗材。 检查分装机工作状况，按《BT00-300T兰格蠕动泵标准操作规程》先调整相关的参数并进行试分装，分液量达标稳定后，按相关指令进行分装。或者用移液器吸取规定的量与试剂瓶中。 实施分装，每分装完总批量的20%后，至少取一瓶进行分液量检验。如超出此范围，则刚分装过的总批量的20%应倒回原液中，并调整分装机的参数，重新分装。 边分装边拧盖，并紧固瓶盖。分装完毕，清点分装数量，计算得率并记录后，装箱贴标识（注明名称、批号、批量、规格、贮存温度、分装日期和分装人及保存期限）后移入一般生产区粘贴标签，如不能及时粘贴标签，应于适当条件保存。 按分装机清洁SOP进行清洁。 自检：确认分装程序符合工艺要求；确认分装记录填写真实、正确。 按相关SOP执行清场，填写清场记录 生产操作程序 贴签 环境：一般生产区。 根据生产指令填写标签制备通知单。 领取已打印好的标签和待贴签液体。 按相关SOP执行标签粘贴。更换不同产品时要清除上批次