2017分子实验复习总结.docxVIP

实验一、植物基因组DNA的提取及电泳 什么是DNA重组技术、克隆、载体 DNA重组技术：基因工程，指不同的DNA片段按照预先的设计定向连接起来，在特定受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。 克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆 载体：将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子 克隆的步骤（基因的获得、载体的连接。。。。） 电泳影响因素（电泳的方向速与什么相关）1.电泳介质的pH 2.缓冲液的离子强度 3.电场强度 4.电渗作用 5.对支持物的选择 6.温度对电泳的影响 电泳的试剂作用（染料是什么，上样缓冲液的作用） 溴化乙锭（染色剂），上样缓冲液（指示电泳程度，维持合适的PH），marker（作为标尺，判断样品的长度） 植物基因组DNA的提取用CTAB法 β-巯基乙醇可以抑制酚类化合物的氧化 EDTA抑制DNA酶的活性 苯酚、氯仿可变性蛋白质 异丙醇沉淀基因组DNA 用RNase去除RNA污染 电泳结果的分析：条带、点带孔里的、RNA污染的 实验二、PCR扩增目的基因 什么是PCR、引物 PCR: 通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性地将DNA某个特定区域扩增出来的技术 引物：指的是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点 PCR主要步骤原理 首先将双链DNA分子在临近沸点温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链 主要的试剂种类：10×反应缓冲液、dNTP、引物1、引物2、模板DNA、Taq DNA酶 结果的分析，会看marker与设计的大小的对应的关系 实验四、T载体连接 T载体：是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接 多克隆位点：包含多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列 TA克隆连接原理（有个A所以能连接） 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基，从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对 P10的图：三个主要箭头是什么 Ampr：氨苄青霉素抗性基因 ori：复制起始位点 lacZ：乳糖操纵子 实验五、感受态细胞制备及转化 转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 感受态细胞：处于容易吸收外源DNA的状态的细胞 感受态细胞制备的原理 细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 蓝白斑与X-Gal、IPTG关系、LacZ与蓝白斑、蓝白斑筛选原理（与转化相连接起来）（为什么蓝，为什么白） IPTG能诱导乳糖操作子转录生成β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-Gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，使菌落呈蓝色。T载体的多克隆位点在lacZ上，经过转化插入外源基因后，lacZ被打断，无法形成完整的酶，故不能切割X-Gal为深蓝色物质。T载体中含有Ampr，使成功转化的细菌能在含Amp的培养基上存活，所以白斑菌落导入的是含有外源基因的质粒，蓝斑导入的是不含外源基因的质粒 实验六 菌落PCR的概念：不提取不鉴定，直接以一个菌体热解暴露的DNA为模板进行PCR扩增。 实验七、质粒DNA的提取、纯化 质粒：细胞染色体外能自主复制的很小的环状DNA分子 提取原理： 在PH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的请柬断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节PH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而去除。 结果分析：三个条带位置关系，质粒三个构型与快慢 开环DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松弛型的环状分子，称为开环DNA 溶液1：Tris（调PH）、EDTA(抑制DNA酶活性，减少对DNA降解) 溶液2：NaOH（碱性调节）、SDS(蛋白质变性) 溶液3：Kac（乙酸钾，中和碱性，使基因组DNA沉淀、质粒