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疑难杂证 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。  曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 疑难杂证 western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？ PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献 疑难杂证 做western，在分子量很低的位置总是出现一条很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？是蛋白降解了吗？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也是可能的，关键是你要的位置出现了吗？ 减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视具体情况了。 疑难杂证 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间? 理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时，分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd，蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可以分开切胶！ 疑难杂证 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。二、与你的转印系统型号有关.三、与目的蛋白的分子量有关.一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h； 疑难杂证 WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请指教 .做WESTERN必须要内参吗？ 1、一抗、或二抗抗体浓度太高2、多克隆抗体本身的非特异性反应3、抗体的特异性不强4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。 疑难杂证 western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 疑难杂证 以下是关于合适抗体选择的优缺点比较，帖子上表格排不齐，只好以图片形式抓了下来。 疑难杂证 为什么细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多，1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；3 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：1 有沉淀可能是因为蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，2 也不排除抗原浓度过高，这时再加入适量sample buffer即可。 疑难杂证 蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间.也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤可 目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，牛奶浓度提高。 疑难杂证 目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一