福建农林大学分子生物学课件-2.pptVIP

Cloning vectors Cloning vectors plasmids bacteriophages Cosmid BAC,YAC animal and plant viruses baculovirus ,retroviruses 质粒 2-200kb 发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母 独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。 Be capable of vectors Replicated and isolated independently of the host’s genome exprsssion vectors: strong promoters selectable marker. 理化因子消除 丫淀橙、EB、利福平、丝裂霉素C、亚硝基胍、高温、紫外线 消除作用不是药物对质粒DNA的破坏，而是对DNA复制的抑制 质粒消除常自发地发生 生物学方法：原生质体形成和再生 理化因子对高度稳定的质粒消除不易奏效 用溶菌酶处理等形成原生质体，再生后菌株便以很高的频率(94%)消除了质粒，如葡萄球菌、枯草杆菌、链霉菌、沙门氏菌等。 消除机制尚不清楚，有人认为去壁形成原生质体时导致了质粒消除,另有认为质粒在原生质体再生过程中丢失的。 质粒载体的设计 双抗生素 蓝白斑筛选 多克隆位点 表达载体 质粒载体多种用途 转录、测序、亚克隆、表达 转化E.coli容易，可重复性高 容易大量分离提纯 质粒载体筛选方法 插入失活 α－互补：IPTG,X-GAL 直接筛选：抗生素 表达筛选（抗体筛选） Probe筛选 质粒载体缺点 ＣaCl2转化效率低 克隆片段小于１０kb 大量筛选时需要细胞裂解 Cosmid vector 带有cos位点的质粒载体 4-6kb，带有选择标记，在构建cDNA文库中很有用。 可携带大的外源DNA片段，克隆 45kb真核基因。 Phasmid载体 含有?噬菌体att位点（插入位点）的质粒。 含有质粒的ori和?噬菌体的ori。 CaMV克隆载体 含1个约8kb的环状双链DNA分子； 用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移； 其感染对植物有害，不能直接做载体； CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。 反转录病毒克隆载体 反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。 只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合适克隆位点，就能在感染的动物细胞中表达。 * 质粒特性： 携带编码多种基因:医学、农业、工业、 环境 细菌进化的重要因子 可以在种内或种间转移 生命和非生命的分水岭：既没有蛋白质外壳，又没有生命外细胞周期，比病毒更简单的原始生命形态，探索生命起源的重要基石。 As important tools： easy to isolate easy to manipulate and transformate in vitro development for DNA clone method to express foreign genes in prokaryotes and eukaryotes 质粒的表型效应 致育性 1946年，Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖，F质粒或性质粒（sexplasmid) 接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程。 绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒 产生抗菌物质和毒素 col（大肠杆菌素因子）： 大肠杆菌素--蛋白质性质的抗菌物质； 大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌 pGKL1和pGKL2：线型DNA质粒，致死效应 乳酸克鲁维酵母 scp1：产生抗生素 编码毒素： 产毒素大肠杆菌（人类和动物腹泻）； 金黄色葡萄球菌（烫伤皮肤综合症）； Bt 对药物和重金属离子抗性 R因子 R1质粒(94kb) 使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性 对金属离子抗性 碲 (Te+6)、砷 (As3+)、汞 (Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等 利用异常营养物 Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等 将许多化学毒物降解。 降解酶由降解性质粒编码 特殊