锁核酸_一种新的反义寡核苷酸.doc

关键词 :反义治疗 ;核苷酸衍生物中图分类号 :Q76 关键词 :反义治疗 ;核苷酸衍生物 中图分类号 :Q76 ;Q524 + . 6 1978 年 , Zamecnik 等1 开创了根据碱基 互补配对原理 ,设计反义寡核苷酸以用于基 因治疗的研究 。相当时间内 ,反义治疗成为 研究领域的 热 点 。至 今 该 研 究 已 经 进 行 了 20 多年 , 但所取得的成果一直不令人满意 。 其中的一个关键问题是反义寡核苷酸的易降 解及杂交结合力不强 。所以 ,近十几年来 ,科 学家们一直在找寻一种强有力的核苷酸替代 物质 。这种物质既要有强大的杂交亲合力及 抗核酸 酶 能 力 , 又 必 须 对 人 体 没 有 毒 性2 。 已经有很多关于各种核苷酸类似物被用于反 义研究的报道 ,如硫代磷酸寡核苷酸 、甲基化 寡核 苷 酸 、肽 核 酸 ( PNA) 等 。近 期 , 锁 核 酸 (locked nucleic acid ,LNA) 作为一种新的核苷 酸类 似 物 引 起 了 人 们 广 泛 的 关 注 。LNA/ DNA 杂合物主要特点有 : ( 1) 不会在血液和 细胞 提 取 液 中 迅 速 降 解 ; ( 2) 可 激 活 RNase H ; (3) 在动物实验中 , 鼠脑注射未导致任何 可检测的毒性反应3 。 由此可见 ,LNA 具有强大的反义活性 ,是 一种较理想的反义物质 。 1 . 什么是 L NA 1994 年 ,Rodriguez 等在发酵副产物中发 现了 LNA4 ,它是一种特殊的双环状核苷酸 衍生物 ,核糖 2′位与 4′位通过缩水作用形成 氧亚甲基桥 、硫亚甲基桥或者胺亚甲基桥 ,连 接成环形 。图 1 为不含碱基的 LNA 单体 ; 图 2 是连接碱基为胸腺嘧啶的 LNA 单体 。 图 1 无碱基 LNA 单体 图 2 胸腺嘧啶 LNA 单体 值得注意的是 ,这样锁合的刚性结构 ,其 立体异构体却很多 ,现文献报道的就有 8 种 , 且其中 4 种已经有了人工合成的报道5 。各 立体异构体的性质不尽相同 ,但相同的是 ,它 们与 DNA 、RNA 、LNA 都有很强的杂交能力 , 杂交物的解链温度 ( Tm 值) 都很高 。已有文 献证 实 ,LNA/ LNA 系 统 是 最 稳 定 的 Watson2 Crik 碱基互补配对系统3 。 2 . L NA 的合成 含 LNA 的序列可以在自动 DNA 合成仪 上合成 ,通过 HPLC 纯化 ,可得到纯度达 90 % 的寡聚物 。合 成 时 使 用 的 依 然 是 氨 基 磷 酸 法 。 不同构型的 LNA 单体 ,其合成方法也不 尽相同 。一般是以 42C2羟甲基呋喃核糖为底 收稿日期 :2001205221 作者简介 :梁浩 (1973 —) ,男 ,助理研究员 ,硕士 。 于实践 。Wahlestedt 等3 以鼠 G 蛋白偶合受体的 mRNA 为靶 于实践 。Wahlestedt 等3 以鼠 G 蛋白偶合受 体的 mRNA 为靶 RNA , 使用 LNA 与 DNA 分 子混合序列 ,反义抑制其表达 。经检测 ,两日 后该受体蛋白浓度下降至 35 % 。 有趣 的 是 , 有 报 道 使 用 八 聚 体 LNA 探 针 ,设计了一种近似 EL ISA 分析的方法 ,对静 脉血栓栓塞中因子 V 的 Leiden 突变进行检 测 ,并获得了成功10 , 其原理与反义治疗异 曲同工 。 4. 展望 作为 一 个 新 的 反 义 物 质 , 虽 然 人 们 对 LNA 还有很多不了解的方面 ,但它已经显示 出作为反义治疗药物的发展前景 。随着对其 研究的进一步深入及合成成本的下降 ,LNA 将会越来越广泛地应用于基 因 研 究 的 各 领 域 。作为一种高亲合力的探针 ,LNA 似乎可 以用于基因芯片等领域 。近期对 LNA 各立 体异构 体 的 研 究 显 示 , 不 同 构 型 的 LNA 与 RNA 等靶 核 酸 的 亲 合 力 并 不 相 同5 。这 就 给予我们以深层次的思考 。 由于对 LNA 的研究需要质谱 、圆二色性 谱等技术鉴定 ,其合成成本也相对较高 ,所以 要想广泛使用尚需在技术方面的革新 。 物 ,经甲磺酰化和缩醛交换作用以得到端基 异构混合物 ,再在硼氢化钠的催化下环化而 成6 。目前 ,研究人员已经成功合成了携带 各种 碱 基 的 LNA 及 脱 氧 开 环 的 LNA , 并 合 成 LNA 、DNA/ LNA 多聚体用于各种研究7 ,8 。 3 . L NA 的应用研究 LNA 的反义优势可以从它与其他反义物 质的对比中得到了解